Bactéries présentes dans un échantillon par méthode de placage sur gélose à la dilution en série ou méthode du dénombrement sur plaque total (TPC)

Nombre total de plaques (TPC):

Dénombrer les bactéries présentes dans un échantillon par la méthode de placage sur gélose avec dilution en série ou la méthode de dénombrement sur plaque total (TPC).

Objectif:

L'étendue de l'activité bactérienne dans un échantillon donné dans un ensemble défini de conditions dépend principalement du nombre total de bactéries présentes dans celui-ci, quelle que soit leur espèce.

Par conséquent, il est très souvent nécessaire de connaître le nombre total de bactéries présentes dans les échantillons d'aliments, d'eau, de sol, d'air et de tissus au cours de leur analyse microbiologique. Ce nombre total de bactéries comprend à la fois les bactéries vivantes et les bactéries mortes ». Les bactéries mortes ne peuvent pas se développer et se reproduire.

Seules les bactéries vivantes (bactéries viables) peuvent se développer et se multiplier, ce qui entraîne une activité bactérienne spécifique. Par conséquent, il est très souvent nécessaire de dénombrer les cellules bactériennes viables dans différents échantillons. Cependant, la plupart des méthodes de dénombrement, telles que la numération microscopique directe, la numération des cellules électroniques, les méthodes chimiques et la méthode spectrophotométrique, comptent les cellules vivantes et les cellules mortes.

Ces méthodes ne peuvent pas distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Par conséquent, la méthode de mise en série sur gélose diluée-gélose, qui énumère uniquement les cellules bactériennes viables, est la méthode universellement utilisée pour compter les cellules viables vivantes dans différents échantillons.

Principe:

Un poids déterminé d’échantillon solide est homogénéisé de manière aseptique dans neuf volumes de solution saline stérile pour obtenir une suspension homogène de bactéries. L'échantillon liquide est directement utilisé comme suspension homogène de bactéries. Les suspensions de bactéries ainsi obtenues sont diluées en série (10 fois, 100 fois, 1000 fois, etc.). Ici, 10 -1, 10 -2, 10 -3, etc. sont appelées dilutions.

Leurs inverses (10 1, 10 2, 10 3, etc.) sont appelées facteurs de dilution. Un volume défini de la suspension de bactéries de chaque dilution est ensemencé sur des plaques de gélose et réparti correctement, de manière à écarter les cellules de bactéries individuelles et à les isoler les unes des autres.

L'inoculation de bactéries pour son énumération se fait selon deux techniques:

1. Technique de la plaque de coulée

2. Technique de la plaque de propagation

1. Technique de coulée:

Dans cette technique, 1 ml de la suspension de bactéries est déposé sur une boîte de Pétri stérilisée, puis un milieu de gélose nutritif liquéfié est versé sur celle-ci. La boîte de Pétri est brassée doucement afin de permettre à la suspension de se mélanger avec le milieu uniformément. Il est autorisé à refroidir et à se solidifier.

2. Technique de la plaque de propagation:

Dans cette technique, on coule 0, 1 ml de la suspension de bactéries sur une plaque de gélose préparée. Ensuite, la goutte de suspension est étalée uniformément sur la plaque de gélose à l'aide d'un écarteur en verre stérilisé.

Pour minimiser les erreurs, chaque suspension diluée est déposée sur 2 à 5 réplicats. Les plaques inoculées sont incubées à 37 ° C pendant 24 heures. Au cours de cette période, chaque cellule bactérienne isolée isolée sur la plaque de gélose se développe et se multiplie rapidement pour produire une masse macroscopique visible de cellules bactériennes appelée «colonie». Ainsi, le nombre de colonies sur la plaque représente le nombre de bactéries dans l'échantillon.

Cependant, très souvent, lors de la propagation, certaines cellules peuvent ne pas être séparées correctement et peu de ces cellules non séparées peuvent donner naissance à une seule colonie. De plus, peu de cellules ont tendance à rester par paires, chaînes ou amas.

Ici, chaque paire, chaîne ou grappe produit une colonie. Ainsi, chaque colonie, au sens strict du terme, ne représente pas une bactérie unique. C’est pourquoi, au lieu d’exprimer le nombre de bactéries par «Non. de bactéries / g ou ml d'échantillon ', il est très souvent exprimé en nombre d'unités formant colonies par g ou ml (UFC / g ou ml).

Le nombre total de plaques (TPC) dans l'échantillon d'origine est calculé en multipliant le nombre de CPU avec les facteurs de dilution respectifs. Les «règles de dénombrement» sont suivies tout en calculant le nombre de bactéries dans l'échantillon d'origine.

Matériaux nécessaires:

Boîtes de Pétri (15 nuls), pipettes de 2 ml (10 nuls), pipette de 10 ml (1 n °), tubes à essai (10 nuls), fioles coniques (500 ml et 1 litre-1 n °), Bécher de 500 ml (2 nos.), Étaleur de verre, boîtier de pipette en acier inoxydable, papier kraft, fil (ou élastique), coton non absorbant, alcool éthylique, chlorure de sodium (NaCl), acide chlorhydrique 0, 1 N, Hydroxyde de sodium 0, 1 N (NaOH), eau distillée, gélose nutritive, échantillon liquide (par exemple eau de bassin / eaux d'égout), échantillon solide (par exemple terre / viande de poisson / viande d'huître / aliments transformés), papier pH (ou pH-mètre), pilon et mortier (ou homogénéisateur), brûleur Bunsen, four à air chaud, autoclave, incubateur, chambre à flux laminaire, compteur de colonies au Québec.

Procédure:

1. Dix pipettes (dans un étui en acier inoxydable), 15 boîtes de Pétri et une paire de pilon et mortier (ou une tasse d'homogénéisateur) sont stérilisés dans un four à air chaud à 180 ° C pendant 3 heures. Ils peuvent aussi être recouverts de papier kraft, noués avec du fil ou d'une bande de caoutchouc et stérilisés à l'autoclave avec le support (Figure 6.6).

Le nombre de boîtes de Pétri et par conséquent la quantité de milieu à utiliser sont calculés en fonction du nombre de répétitions et de dilutions nécessaires. Ici, la verrerie et le milieu ont été utilisés pour une réplication simple et une dilution jusqu’à 10 -6 . Le nombre de verreries et la quantité de milieu à stériliser sont légèrement plus importants pour éviter toute erreur fortuite, car la stérilisation est un processus long.

2. On dissout 4, 25 g de NaCl dans 500 ml d'eau distillée pour obtenir du sérum physiologique (0, 85%). On verse 225 ml de cette solution saline dans une fiole conique de 500 ml. Sa bouche est en coton bouché, recouverte de papier kraft et nouée avec du fil ou un élastique. Il est utilisé comme premier diluant pour diluer l'échantillon solide.

3. On pipette également 9, 0 ml de la solution saline restante dans chacun des 10 tubes à essai. Leurs bouches sont en coton bouché, recouvertes de papier kraft et nouées avec du fil ou un élastique. Ceux-ci sont utilisés comme diluants pour une dilution en série.

4. Les ingrédients du milieu gélose nutritive ou de sa poudre prête à l'emploi nécessaires pour 500 ml de milieu sont pesés et dissous dans 500 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 1 litre par agitation et tourbillonnement.

Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 0 à l'aide d'HCI 0, 1 N s'il est supérieur ou de NaOH 0, 1 N s'il est inférieur. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu. Ensuite, il est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou une bande de caoutchouc.

5. La fiole conique de 500 ml contenant 225 ml de solution saline, les 10 éprouvettes contenant chacune 9 ml de solution saline et la fiole conique de 1 litre contenant 500 ml de milieu gélose sont stérilisées à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes. dans un autoclave.

6. Après la stérilisation, les matériaux stérilisés sont retirés de l'autoclave et laissés à refroidir pendant un certain temps, sans laisser le milieu se solidifier. Le refroidissement du fluide empêche la condensation et l’accumulation de gouttelettes d’eau à l’intérieur des plaques. Si le support a déjà été préparé et solidifié pendant le stockage, il doit être liquéfié en chauffant soigneusement jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

7. Pour préparer les boîtes de gélose, avant de refroidir et de solidifier le milieu de gélose nutritif stérilisé, à chaud, il est versé de manière aseptique dans les 6 boîtes de Pétri stérilisées (environ 20 ml chacune), de sorte que le milieu en fusion recouvre le fond du pétri. la vaisselle complètement.

Ensuite, les plaques sont recouvertes de leurs couvercles et laissées à refroidir, afin de solidifier le milieu en eux. La vapeur d'eau susceptible de se condenser sur la surface intérieure des plaques et des couvercles est évaporée en maintenant les plaques et les couvercles en position inversée dans un incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure.

8. Le poids de l'échantillon solide (par exemple, viande de poisson / viande d'huître / aliments transformés) est homogène et homogénéisé dans 225 ml de solution saline stérilisée (diluant) de manière aseptique (figure 6.7). Cela donne une dilution de 10 fois (dilution = 10 -1 ). Pour l’échantillon liquide, 1 ml d’échantillon est pipeté de manière aseptique dans un tube de solution saline stérilisée de 9 ml. Cela donne également une dilution de 10 fois (dilution = 10 -1 ).

9. 1 ml de la dilution 10 -1 est transféré dans 9 ml de solution saline stérilisée dans un autre tube à essai. Cela donne une dilution de 100 fois (dilution = 10 -2 ). À partir de la dilution 10 -2, on verse 1 ml dans une boîte de Pétri stérilisée et 0, 1 ml sur une plaque de gélose, à partir de la même pipette. Pour chaque dilution, une pipette stérilisée distincte est utilisée. Après utilisation, il est plongé dans le pot à jeter.

10. 1 ml de la dilution 10 -2 est transféré dans 9 ml de solution saline stérilisée dans un autre tube à essai. Cela donne une dilution de 1000 fois (dilution = 10 -3 ). A partir de la dilution 10 -3, on introduit goutte à goutte 1 ml dans une boîte de Pétri stérilisée et 0, 1 ml sur une plaque de gélose, à partir de la même pipette. De manière similaire, la dilution est poursuivie jusqu'à 10 -6 en série, en transférant chaque fois 1 ml dans une boîte de Pétri stérilisée et 0, 1 ml dans une plaque d'agar à partir de la même pipette.

11. Ensuite, les gouttes de suspension sur les plaques de gélose sont réparties de manière aseptique à l'aide d'un distributeur en verre stérilisé. Après l'étalement dans chaque assiette, il est stérilisé à la flamme en le plongeant dans de l'alcool et en le laissant apparaître sur une flamme. C'est la "technique de la plaque de propagation".

12. Les boîtes de Pétri contenant chacune 1 ml de suspension de bactéries sont prélevées et on y verse de la gélose nutritive liquéfiée stérilisée. On les fait tourner doucement pour permettre à la suspension de se mélanger uniformément au milieu. Les plaques sont laissées à refroidir jusqu'à ce que le milieu se solidifie. C'est la technique de «couler la plaque».

13. Ensuite, les plaques sont incubées en position inversée, de haut en bas, à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur (figure 6.7).

14. Une plaque d'agar non inoculée est incubée à titre de contrôle pour assurer une stérilisation appropriée, comme le montre l'absence de croissance.

Observations:

Le nombre de colonies de bactéries sur les plaques est compté directement ou à l'aide d'un compteur de colonies au Québec. À partir de là, le nombre de bactéries présentes par gramme ou par ml de l'échantillon d'origine est calculé. Ceci s'appelle une énumération.

Règles de recensement:

1. Des boîtes de Pétri de 30 à 300 colonies doivent être envisagées.

2. Le nombre moyen de doublons et de triplets (R 1, R 2, R 3 …) n'est pris en compte que si l'un des chefs ne dépasse pas le double de l'autre. Si l'un est plus du double de l'autre, une valeur inférieure est prise.

3. Pour la technique de coulée sur plaque, le nombre de bactéries est n ° X 10 c / g, où c = facteur de dilution. Pour la technique de la plaque étalée, le nombre de bactéries est N ° X10 c + 1 / gm, où c = facteur de dilution. Le nombre est converti en deux décimales sous la forme de (x.yz X 10 m ). Par exemple, 288 x 10 4 est exprimé par 2, 88 x 10 6 .

4. Si, dans toutes les dilutions, le nombre de colonies est supérieur à 300, compter pour la dilution la plus élevée et si pour toutes les dilutions, il est inférieur à 30, compter pour la dilution la plus faible. Dans les deux cas, le nombre est représenté comme suit: Nombre estimé X 10 c / g ou ml pour la technique de coulée sur plaque et Nombre estimé de X 10 c + 1 / gm ou ml pour la technique de plaque étalée.

5. Si aucune dilution n’est observée dans les colonies, elle est représentée par: Estimation <1 x plus faible dilution.

6. Comme la dilution en série a lieu 10 fois, mathématiquement, il est évident que deux dilutions ne peuvent avoir de colonies comprises entre 30 et 300. Par exemple, si 10 -3 a 50 colonies, 10 -2 devrait en avoir 500 (c'est-à-dire> 300) et 10 -4 devraient avoir 5 (c'est-à-dire <30) colonies.

Cependant, cela ne se produit pas dans la réalité, car les bactéries ne se présentent pas sous forme de solution homogène; se produire plutôt comme une suspension dans les diluants. S'il y a deux dilutions ayant des colonies dénombrables (entre 30 et 300), calculez d'abord le nombre d'unités formatrices de colonies / g ou ml en utilisant chaque dilution.

Si une valeur est plus du double de l'autre, indiquez la valeur la plus basse. Sinon, prenez la moyenne des deux valeurs et signalez cette valeur.