Culture de bactéries à partir d'échantillons solides, liquides et sur écouvillons (avec figure)

Objectif:

Les principaux objectifs de la culture de bactéries sont les suivants:

1. Augmenter le nombre de bactéries, de manière à les rendre visibles, sous forme de colonies ou de suspensions.

2. Isolement des bactéries.

3. Maintien de la culture pure et des cultures standard.

4. Dénombrement des bactéries dans les échantillons.

5. Détection de bactéries d'intérêt particulières dans un échantillon et son dénombrement.

6. Identification des bactéries à partir des caractéristiques des colonies, des caractéristiques de croissance sur les pentes et des activités biochimiques dans différents milieux.

Cependant, le but de cette expérience est uniquement de cultiver des bactéries à partir d'échantillons liquides, solides et de surface dans des milieux solides et liquides, afin de les obtenir sous des formes visibles, respectivement en tant que colonies ou en suspension.

Principe:

Les bactéries sont cultivées dans des milieux liquides ou solides stérilisés et riches en nutriments. Le milieu liquide, appelé bouillon, est contenu dans des éprouvettes pour former des "tubes à bouillon", tandis que le milieu solide, appelé milieu agar, est contenu dans des boîtes de Pétri pour former des "plaques d'agar" ou simplement des "plaques". La culture de bactéries nécessite un matériau qui pourrait contenir des bactéries.

La plupart des choses que nous voyons contiennent des bactéries. Ils sont présents dans les grattoirs, la nourriture, le sol, l'eau, les matières fécales et même dans les milieux microbiologiques non stérilisés. Une quantité déterminée de la suspension homogène de tout matériau contenant des bactéries est inoculée dans le milieu stérilisé de manière aseptique et incubée dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 heures.

Dans le bouillon liquide, les bactéries se développent en suspension et le rendent trouble. Sur des plaques de gélose solides, ils se développent en colonies; chaque colonie provenant d'une seule bactérie. La culture des bactéries se fait en cinq étapes.

1. Préparation du média

2. Stérilisation des objets en verre et des objets en verre

3. Inoculation

4. Incubation

5. Observation

1. Préparation du média:

Habituellement, lors de la préparation d'un bouillon liquide et d'un milieu semi-solide, les ingrédients sont pesés dans les proportions prescrites et dissous dans la quantité d'eau requise. Il existe actuellement des poudres prêtes à l'emploi contenant les ingrédients dans les proportions requises.

Lors de la préparation du bouillon liquide, la quantité de poudre prescrite (indiquée sur l'étiquette de l'emballage) est pesée et dissoute dans la quantité requise d'eau dans une fiole conique. Les ingrédients sont dissous par chauffage, versés dans des éprouvettes et stérilisés à l'autoclave.

Toutefois, lors de la préparation de plaques solides, de pentes et de tubes profonds, la quantité de poudre prescrite (indiquée sur l'étiquette de l'emballage) est pesée et dissoute dans la quantité d'eau requise dans une fiole conique. Ce milieu préparé est d'abord stérilisé à l'autoclave puis laissé refroidir pendant un certain temps.

Tandis qu'il est encore chaud, avant de se solidifier, il est versé dans des boîtes de Pétri ou des tubes à essai stérilisés, puis laissé se solidifier après refroidissement à la température ambiante. Les supports très chauds ne doivent jamais être versés dans des conteneurs car ils entraînent la condensation de l’eau sur la paroi des conteneurs, qui tombe à la surface du support et peut entraîner sa contamination.

2. Stérilisation

Les objets en verre sont stérilisés dans un four à air chaud à 180 ° C pendant 3 heures et les milieux en autoclave à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes. Les verreries peuvent également être stérilisées à l'autoclave, mais les supports ne doivent jamais être stérilisés au four, car l'eau s'échappe des supports et se déshydrate.

3. Inoculation:

Les échantillons liquides sont supposés être des suspensions homogènes de bactéries. Par conséquent, pour la culture en bouillon, un volume défini d’échantillon est pipeté dans le bouillon de manière aseptique. Pour la culture sur des plaques d'agar, un volume défini de l'échantillon est pipeté sur la plaque d'agar solide et étalé sur la surface du milieu de manière aseptique.

Pour les échantillons solides, un échantillon de poids défini est homogénéisé de manière aseptique dans un volume défini de solution saline physiologique normale (chlorure de sodium à 0, 85%) en utilisant un mortier et un pilon stérilisés ou un mélangeur. La plupart des agents pathogènes humains sont isotoniques pour le corps humain (chlorure de sodium à 0, 85%).

Le rapport échantillon / solution saline est généralement de 1: 9 (1 g + 9 ml; 10 g + 90 ml; 25 g + 225 ml ou 50 g + 450 ml). Un volume défini de ce liquide homogénéisé, qui est supposé être une suspension homogène de bactéries, est pipeté de manière aseptique dans le bouillon stérilisé dans des éprouvettes pour la culture en bouillon. Pour la culture sur des plaques de gélose, la suspension liquide est pipetée sur la surface des plaques et répartie de manière aseptique.

Pour les échantillons de surface prélevés pour étudier la microbiologie des surfaces solides (dessus de table, surfaces corporelles ou plaies), la surface est frottée avec un coton-tige stérilisé. L'écouvillon est touché à la surface d'une plaque d'agar stérilisée. Au point de contact, les stries sont faites par une boucle stérilisée de manière aseptique, de manière à isoler les bactéries.

4. Incubation:

Les tubes et les plaques de bouillon inoculés sont incubés à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur.

5. Observation:

La turbidité dans le bouillon liquide et les colonies sur les plaques de gélose indique une croissance des bactéries.

Matériel requis:

Boîtes de Pétri (6 nos.), Pipettes de 2 ml (5 nos.), Tubes à essai (5 nos.), Fioles coniques (100 ml, 250 ml et 500 ml-l), bêcher de 250 ml (2 nos.), Verre étaleur, étui de pipette en acier inoxydable, papier kraft, fil (ou élastique), coton non absorbant, petits bâtons, boucle, alcool éthylique, chlorure de sodium (NaCl), acide chlorhydrique 0, 1 N (HCI), hydroxyde de sodium 0, 1 N (NaOH) ), eau distillée, bouillon nutritif, gélose nutritive, échantillon liquide (par exemple, eau de bassin), échantillon solide (par exemple, sol), échantillon superficiel (par exemple, dessus de table, surface corporelle, plaie), papier pH (ou pH-mètre), pilon et mortier (ou homogénéisateur), brûleur Bunsen, four à air chaud, autoclave, incubateur, chambre à flux laminaire.

Procédure:

1. Cinq pipettes (dans un boîtier en acier inoxydable), six boîtes de Petri et une paire de pilon et mortier (ou une coupe homogénéisatrice) sont stérilisés à 180 ° C pendant 3 heures dans un four à air chaud. Ils peuvent aussi être recouverts de papier kraft, noués avec du fil ou une bande de caoutchouc et stérilisés à l'autoclave avec le support (Figure 6.1).

2. On dissout 0, 85 g de NaCl dans 100 ml d'eau distillée dans un bécher de 250 ml et on verse 90 ml de cette solution saline dans une fiole conique de 100 ml. La bouche est en coton bouché, recouverte de papier kraft et attachée avec du fil ou un élastique.

3. Les ingrédients du milieu de bouillon nutritif nécessaires pour 100 ml du bouillon sont pesés. Alternativement, la quantité prescrite de poudre de bouillon nutritif prête à l'emploi (mélange d'ingrédients) est pesée.

4. Les ingrédients (ou la poudre prête à l'emploi) sont dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation et tourbillonnement. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre. Le pH est ajusté à 7, 0 en utilisant HCl 0, 1 N s'il est supérieur ou en utilisant NaOH 0, 1 N s'il est inférieur. Le ballon est chauffé, si nécessaire, pour dissoudre complètement les ingrédients.

5. Le bouillon est réparti dans 5 tubes à essai (environ 10 ml chacun), la bouche bouchée avec du coton, recouverts de papier kraft et noués avec du fil ou un élastique.

6. Les ingrédients du milieu gélose nutritive ou de la poudre préparée nécessaires pour 200 ml de milieu sont pesés et dissous dans 200 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 500 ml par agitation et tourbillonnement.

Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 0 à l'aide d'HCI 0, 1 N s'il est supérieur ou de NaOH 0, 1 N s'il est inférieur. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu. Ensuite, il est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou une bande de caoutchouc.

7. Les écouvillons sont fabriqués en tordant le coton autour des pointes de petits bâtons. Peu de tels écouvillons sont conservés dans une éprouvette avec les extrémités en coton vers le bas. Le tube à essai est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

8. La fiole conique de 100 ml avec 90 ml de solution saline, les 5 tubes à essai avec bouillon nutritif, la fiole conique de 500 ml contenant 200 ml de gélose nutritive et le tube à essai contenant les écouvillons sont stérilisés à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant une seconde. 15 minutes en autoclave.

9. Après la stérilisation, les matériaux stérilisés sont retirés de l'autoclave et laissés à refroidir pendant un certain temps, sans laisser le milieu se solidifier. Le refroidissement du fluide empêche la condensation et l’accumulation de gouttelettes d’eau à l’intérieur des plaques. Si le support a déjà été préparé et solidifié pendant le stockage, il doit être liquéfié en chauffant soigneusement jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

10. Pour préparer des boîtes de gélose nutritive, avant de refroidir et de solidifier le milieu de gélose nutritif stérilisé, on le coule aseptiquement dans les 6 boîtes de Pétri stérilisées (environ 20 ml chacune), de sorte que le milieu fondu couvre le fond de les boîtes de pétri complètement.

Ensuite, les plaques sont recouvertes de leurs couvercles et laissées à refroidir, afin de solidifier le milieu en eux. La vapeur d'eau susceptible de se condenser sur la surface intérieure des plaques et des couvercles est évaporée en maintenant les plaques et les couvercles en position inversée dans un incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure.

11. L'échantillon de liquide (suspecté de contenir des bactéries, par exemple de l'eau de bassin) est prélevé. Un ml de chacun des échantillons est pipeté de manière aseptique dans 2 tubes de bouillon (Figure 6.2). Les tubes sont tourbillonnés. L’échantillon liquide est également pipeté de manière aseptique sur 2 plaques de gélose de 0, 1 ml et étalé sur la surface du milieu gélosé à l’aide d’un répartiteur de verre stérilisé à la flamme.

Avant chaque épandage par l'épandeur de verre, il est trempé dans de l'alcool et flambé au-dessus d'un bec bunsen. Les tubes et les plaques de bouillon inoculés sont incubés à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur. Les plaques sont incubées en position inversée, de haut en bas.

12. Pour l'échantillon solide (par exemple, le sol), 10 g de l'échantillon sont pesés de manière aseptique et homogénéisés dans le pilon et le mortier stérilisés ou dans une coupelle d'homogénéisation après avoir ajouté 90 ml de la solution saline stérilisée provenant de la fiole conique de 100 ml.

Cette suspension bactérienne homogène est pipetée de manière aseptique dans 2 tubes de bouillon et 2 boîtes de gélose comme à l'étape 11 et incubée à 37 ° C pendant 24 heures dans l'incubateur (figure 6.2). Les plaques sont incubées en position inversée, de haut en bas.

13. Pour l'échantillonnage de surface, la surface présumée contenir des bactéries (dessus de table, surface du corps, plaie) est marquée pour une unité de surface (par exemple 1 cm ² ), qui est frottée avec un écouvillon stérilisé. L'écouvillon est touché sur la surface des deux plaques d'agar laissées.

Les stries sont effectuées de manière aseptique par une boucle stérilisée à la flamme. Pour les traînées, des lignes presque parallèles sont tracées par la boucle à partir du point de contact du coton-tige. Ceux-ci forment les stries principales. Après stérilisation à la flamme de la boucle, les traînées secondaires sont dessinées presque en diagonale par rapport aux traînées principales. De manière similaire, les stries tertiaires et quaternaires sont réalisées de manière aseptique.

14. Ensuite, les plaques sont incubées en position inversée, de haut en bas, à 37 ° C pendant 24 heures dans l'incubateur (figure 6.2).

15. Une plaque de gélose non inoculée et un tube de bouillon non inoculé sont incubés à titre de contrôle pour assurer une stérilisation appropriée, comme indiqué par l'absence de croissance. Cette étape est facultative.