Test de désoxyribonucléase sur bactéries afin de déterminer leurs capacités d'hydrolyse de l'ADN (avec figure)

Test de désoxyribonucléase (test DNase) sur des bactéries pour déterminer leurs capacités d'hydrolyse de l'ADN (avec figure)!

Principe:

Certaines bactéries ont la capacité d'hydrolyser l'acide désoxyribonucléique (ADN) en oligonucléotides, car elles peuvent produire l'enzyme hydrolytique extracellulaire «désoxyribonucléase» (DNase).

Alors que l'ADN est précipité par une opacité produisant de l'acide chlorhydrique, ses produits finis hydrolysés, les oligonucléotides, ne sont pas précipités par l'acide chlorhydrique, pour lequel ils ne produisent pas une telle opacité; plutôt produire de la transparence.

Dans le test à la DNase, les bactéries à tester sont cultivées sur des plaques de gélose contenant de l'ADN. Une fois que les colonies de bactéries sont visibles, les plaques sont inondées d’acide chlorhydrique. Si les bactéries ont la capacité d'hydrolyser l'ADN, ses colonies hydrolysent l'ADN du milieu dans les zones environnantes, tandis que le reste des zones des plaques contient de l'ADN non hydrolysé.

En conséquence, lorsqu’ils sont inondés d’acide chlorhydrique, des zones claires et transparentes se forment autour des colonies, car les produits hydrolysés, les oligonucléotides formés autour d’eux, ne forment pas de précipités avec l’acide chlorhydrique.

D'autre part, le reste des zones des plaques devient opaque, car l'ADN non hydrolysé dans ces zones forme des précipités avec l'acide chlorhydrique. Si du bleu de toluidine est utilisé à la place de l'acide chlorhydrique, un halo rose pâle n'est produit que autour des colonies.

Matériaux nécessaires:

Boîtes de Pétri, fiole conique, tampons de coton, boucle d'inoculation, autoclave, brûleur Bunsen, chambre à flux laminaire, bocal, incubateur, gélose à la DNase, acide chlorhydrique IN (ou 0, 1% de bleu de toluidine), colonies isolées ou cultures pures de bactéries.

Procédure:

1. Deux boîtes de Pétri sont nettoyées, recouvertes de papier kraft et attachées avec du fil ou une bande de caoutchouc (Figure 7.23). Cette étape ainsi que la stérilisation des boîtes de Pétri à l'étape 6 sont omises si les boîtes de Pétri stérilisées au four sont utilisées directement.

2. Les ingrédients du milieu gélose DNase (contenant l'ADN comme composant principal) ou de sa poudre prête à l'emploi nécessaire pour 100 ml de milieu sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation et tourbillonnement.

3. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 2 en utilisant HCI 0, 1 N s'il est supérieur ou à l'aide de NaOH 0, 1 N s'il est inférieur.

4. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

5. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

6. Les deux boîtes de Pétri et la fiole conique contenant le milieu de gélose à la DNase sont stérilisées à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

7. Après la stérilisation, ils sont sortis de l'autoclave et laissés à refroidir pendant un certain temps, sans laisser le milieu se solidifier. Le refroidissement du fluide empêche la condensation et l’accumulation de gouttelettes d’eau à l’intérieur des plaques. Si le support a déjà été préparé et solidifié pendant le stockage, il doit être liquéfié en chauffant soigneusement jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

8. Pour préparer les boîtes de gélose à la DNase, avant de refroidir et de solidifier le milieu de gélose à la DNase stérilisé, à chaud, il est versé de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, dans les deux boîtes de Pétri stérilisées (environ 20 ml chacune), de sorte le milieu fondu recouvre complètement le fond des boîtes de Pétri.

Ensuite, les plaques sont recouvertes de leurs couvercles et laissées à refroidir, afin de solidifier le milieu en eux. La vapeur d'eau susceptible de se condenser sur la surface intérieure des plaques et des couvercles est évaporée en maintenant les plaques et les couvercles en position inversée dans un incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure.

9. Chaque plaque est marquée sur le côté inférieur en quatre quarts.

10. L'inoculation localisée des bactéries à tester est réalisée de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, au centre de chaque quartier en effectuant une tache (ou un petit frottis) de la bactérie à l'aide d'une boucle stérilisée à la flamme. La boucle est stérilisée après chaque inoculation.

11. Les plaques inoculées sont incubées en position inversée, de haut en bas, à 37 ° C pendant 24 à 48 heures dans un incubateur jusqu'à ce que des colonies de la bactérie soient visibles.

12. Les plaques sont immergées dans une solution d'acide chlorhydrique 1 N (ou 0, 1% de bleu de toluidine).