Réplication de l'ADN: Notes sur la réplication semi-conservatrice de l'ADN

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La réplication est le processus de formation de copies carbone. Pour cela, l'ADN fonctionne comme son propre modèle. Par conséquent, la réplication de l'ADN est une fonction autocatalytique de l'ADN.

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Il survient généralement pendant la phase S du cycle cellulaire lorsque les chromosomes sont très étendus. Comme proposé par Watson et Crick, la réplication de l'ADN est semi-conservative (un type de réplication dans lequel un brin du duplex fille est dérivé du parent tandis que l'autre est reconstitué).

Ceci est réalisé par la séparation de deux brins. Les brins séparés fonctionnent comme des modèles. Les nouveaux brins construits sur les gabarits des anciens brins auront des paires de bases complémentaires (A opposé à T et G opposé à C). Les molécules d'ADN des deux filles ainsi formées seront des copies conformes de la molécule mère, mais comporteront un nouveau brin et un ancien.

Taylor et al. (1957) ont nourri des cellules en division d'extrémités radiculaires de fève (Vicia faba) avec du 3H radioactif contenant de la thymine au lieu de la thymine normale. La thymine est incorporée à l’ADN, qui est l’élément structural des chromosomes. Taylor et al ont constaté que tous les chromosomes devenaient radioactifs.

La thymine marquée a ensuite été remplacée par une autre. La génération suivante est devenue radioactive dans l’une des deux chromatides de chaque chromosome, tandis que la génération suivante était présente dans 50% des chromosomes (Fig. 6.9). Cela n'est possible que si, sur les deux brins d'un chromosome, l'un est à nouveau formé, tandis que l'autre est conservé à chaque réplication, il s'agit d'une réplication semi-conservative.

La réplication semi-conservatrice de l'ADN a été prouvée par les travaux de Mathew Meselson et Franklin Stahl (1958). Ils ont cultivé Escherichia coli pendant de nombreuses générations dans un milieu contenant un isotope lourd d’azote, sous la forme de ¹⁵ NH ₄ Cl, jusqu’à ce que l’ADN bactérien soit complètement marqué à l’isotope lourd.

Les bactéries marquées ont ensuite été déplacées vers un milieu frais contenant de l'azote normal ou 14N. Des échantillons ont été prélevés pour chaque génération (une génération prend 20 minutes lorsque E. coli se divise en 20 minutes) et l'ADN a été testé pour déterminer l'isotope lourd de l'azote par centrifugation sur gradient de densité à l'aide de chlorure de césium. Le chlorure de césium est un sel lourd hautement soluble dans l'eau.

Lorsqu'il est centrifugé à une vitesse élevée (par exemple 50 000 tours par minute) dans une centrifugeuse, le sel forme un gradient de densité avec la région la plus concentrée la plus lourde au fond et une concentration plus légère progressivement plus concentrée vers la surface. Lorsque l'ADN est mélangé avec du chlorure de césium, il se déposera à une hauteur donnée lors de la centrifugation, plus lourd vers la base et plus léger vers le haut (figure 6.10).

Le fluorure de chrome appelé bromure d'éthidium est utilisé pour améliorer le contraste car le fluorochrome est spécifique de l'ADN. Meselson et Stahl ont découvert que l'ADN de la première génération était hybride ou intermédiaire ( ¹⁵ N et ¹⁴ N). Il s'est déposé dans une solution de chlorure de césium à un niveau supérieur à celui de l'ADN entièrement marqué de la bactérie mère ( ¹⁵ N ¹⁵ N). La deuxième génération de bactéries après 40 minutes contenait deux types d’ADN: 50% de lumière ( ¹⁴ N ¹⁴ N) et 50% d’intermédiaire ( ¹⁵ N ¹⁴ N).

La troisième génération de bactéries après 60 minutes contenait deux types d’ADN: 25% intermédiaire ( ¹⁵ N ¹⁴ N) et 75% de lumière ( ¹⁴ N ¹⁴ N) dans un rapport 1: 3. La quatrième génération après 80 minutes contenait 12, 5% d'ADN 15N 14N et 87, 5% d'ADN 14N 14N dans un rapport 1/7.

Cette observation n’est possible que si les deux brins de l’ADN duplex se séparent au moment de la réplication et servent de matrice à la synthèse de nouveaux brins complémentaires d’ADN normaux ou ¹⁴ N. Cela produira deux duplex d’ADN avec un ancien brin ( ¹⁵ N) et un nouveau brin ( ¹⁴ N).

Au cours de la formation de deuxième génération, les brins ¹⁵ et ¹⁴ N de duplex d’ADN se séparent pour fonctionner en tant que matrices, de sorte que 50% des nouveaux duplex d’ADN ne possèdent que des brins normaux ou ¹⁴ N, tandis que 50% possèdent des brins ¹⁵ N et ¹⁴ N (Fig. 6.11 & 6.12). De cette manière, à chaque réplication, un brin d'ADN parent est conservé dans la fille alors que le second est fraîchement synthétisé.