Expérience de culture et d'énumération d'un bactériophage

Expérience pour cultiver et énumérer un bactériophage!

Principe:

Une suspension de bactéries sensibles à un bactériophage (virus infectant les bactéries) est ensemencée avec ce bactériophage et laissée se développer sous la forme d'une pelouse confluente sur une plaque de gélose.

Les particules de bactériophage se développent dans les cellules bactériennes et les lysent. La lyse des cellules bactériennes entraîne la formation de zones claires dans la pelouse confluente de bactéries. Ces zones claires sont appelées "plaques". Chaque zone claire est supposée être formée par une seule particule de bactériophage. Ainsi, le nombre d'unités formant une plaque (UFP) représente le nombre de bactériophages.

La technique de dilution en série est utilisée pour le dénombrement de bactériophages similaire à celui utilisé pour le dénombrement de bactéries. Le nombre de particules de phage contenues dans un échantillon est déterminé en comptant le nombre de plaques formées sur la plaque de gélose ensemencée et en le multipliant par le facteur de dilution.

Pour déterminer un nombre de phages valide, le nombre de plaques par plaque ne doit pas dépasser 300 ni être inférieur à 30. Les plaques présentant plus de 300 UFP sont appelées «trop nombreuses pour être comptées» (TNTC), tandis que les plaques présentant moins de 30 UFP sont désignées «trop peu pour compter» (TFTC).

Matériaux nécessaires:

Bouillon tryptone, agar doux tryptone, agar dur tryptone, fiole conique, éprouvettes, boîtes de Pétri stérilisées, tampons de coton, culture stock de bactériophages (ex: coliphage T 2 ), culture en bouillon nutritif de la bactérie (Ex: Escherichia coli B), pipettes stérilisées, autoclave, bain-marie chaud, bec bunsen, chambre à flux laminaire, jeter le bocal, incubateur.

Procédure:

1. Quinze pipettes (dans un boîtier de pipette en acier inoxydable) et cinq boîtes de Petri sont stérilisées dans un four à air chaud à 180 ° C pendant 3 heures. Ils peuvent également être recouverts de papier kraft, noués avec du fil ou une bande de caoutchouc et stérilisés dans un autoclave avec le support (Figure 8.3).

2. Les ingrédients du bouillon tryptone ou de sa poudre prête à l'emploi, nécessaires pour 100 ml de bouillon, sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation et tourbillonnement. Son pH est ajusté à 7, 5 en utilisant du HCl 0, 1 N ou du NaOH 0, 1 N selon les besoins. Le ballon est chauffé, si nécessaire, pour dissoudre complètement les ingrédients.

3. Le bouillon est réparti dans 10 tubes à essai (de 9 ml chacun) bouchés avec du coton, recouverts de papier kraft et noués avec du fil ou une bande de caoutchouc.

4. Les ingrédients du milieu gélose tryptone soft ou de sa poudre prête à l'emploi, nécessaires pour 100 ml de milieu, sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation et tourbillonnement. Son pH est ajusté à 7, 5 en utilisant du HCl 0, 1 N ou du NaOH 0, 1 N selon les besoins. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

5. Ce milieu liquide est réparti dans 5 tubes à essai (de 2 ml chacun) bouchés avec du coton, recouverts de papier kraft et noués avec du fil ou une bande de caoutchouc.

6. Les ingrédients du milieu à la gélose tryptone dure ou de sa poudre prête à l'emploi, nécessaires pour 100 ml de milieu, sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par chauffage après ajustement du pH à 7, 5. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

7. Les 10 tubes de bouillon à la tryptone, les 5 tubes de gélose à la tryptone molle et le ballon contenant le milieu de gélose à la tryptone dure sont stérilisés à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

8. Le milieu de gélose à la tryptone dure stérilisée dans la fiole conique est versé dans 5 boîtes de Pétri stérilisées de manière aseptique pour obtenir 5 plaques de gélose à la tryptone dure.

9. Un ml de la culture mère du bactériophage (ex: T 2 coliphage) est transféré de manière aseptique, de préférence dans une chambre à flux laminaire, dans un tube à bouillon de tryptone (9 ml) à l'aide d'une pipette stérilisée. Cela devient la dilution 10 fois (soit 10 -1 ). Celui-ci est dilué de manière aseptique dans les neuf autres tubes de bouillon, de manière à obtenir une dilution finale de 10 -10 (figure 8.4).

10. Les 5 tubes de gélose molle tryptone stérilisés sont prélevés et chauffés au bain-marie à 100 ° C afin de faire fondre la gélose. Les tubes sont refroidis et les tubes souples mous fondus sont maintenus à 45 ° C.

11. Parmi les 10 tubes ci-dessus contenant des phages à différentes concentrations, cinq tubes (à savoir 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 et 10 -9 ) sont sélectionnés. A partir de ces tubes, 1 ml chacun est transféré de manière aseptique dans les cinq tubes de gélose molle tryptone à l'aide de pipettes stérilisées séparées.

12. Deux gouttes de culture en bouillon nutritif de la bactérie (Ex: Escherichia coli B) sont transférées de manière aseptique, de préférence dans une chambre à flux laminaire, dans chaque tube de gélose à la tryptone contenant le bactériophage à cinq concentrations différentes (10 -5 à 10 -9 ).

13. Le contenu des cinq tubes de gélose molle de tryptone contenant le bactériophage et les bactéries est rapidement mélangé par rotation entre les paumes des mains.

14. Le contenu est versé de manière aseptique sur les cinq plaques de gélose à la tryptone dure marquées 10 -5 à 10 -9, formant ainsi une préparation de culture sur plaque à double couche. Les plaques tourbillonnent doucement et on les laisse durcir.

15. Les plaques sont incubées en position inversée à 37 ° C dans un incubateur.

Observations:

1. Toutes les plaques sont observées pour les unités de formation de plaque (UFP) qui se développent en tant que zones claires sur la pelouse de bactéries.

2. Seules les plaques ayant des UFP entre 30 et 300 sont considérées pour le dénombrement du phage. Le nombre de PFU sur chaque plaque est compté. Les plaques présentant plus de 300 UFP sont désignées par «trop nombreuses pour être comptées» (TNTC), tandis que les plaques présentant moins de 30 UFP désignées par «trop peu pour compter» (TFTC). De telles plaques ne sont pas considérées.

3. Sur la base des observations, le nombre de bactériophages par ml de culture sur phage de stock est calculé à l'aide de la formule suivante.

Nombre de phages / ml = Nombre de PFU X facteur de dilution

Par exemple, si le nombre de PFU est de 280 pour une dilution de 10 -7, le nombre de phages dans la culture mère de phage est de 280 x 10 7 phages / ml (= 2, 80 x 10 9 phages / ml).