Expérience d'isolement du coliphage d'un virus (avec diagramme)

Expérience pour isoler le coliphage d'un virus!

Principe:

Le bactériophage ou phage (virus) qui infecte la bactérie, Escherichia coli, est appelé coliphage (coli: E. coli-, phage: bactériophage).

Il peut être obtenu à partir de diverses sources naturelles, telles que le sol, les matières fécales et les eaux usées non traitées. Son isolement de ces sources n’est pas très facile, car il est présent à faible concentration.

Par conséquent, son nombre est d'abord augmenté par une étape d'enrichissement, au cours de laquelle une culture riche de la bactérie hôte (c'est-à-dire E. coli) est ajoutée à l'échantillon contenant le coliphage et incubée. Le coliphage infecte E. coli et son nombre augmente abondamment. Cette culture riche en coliphages est centrifugée pour déposer les particules.

Les sédiments sont jetés et le surnageant filtré à travers un filtre microbien pour retenir les bactéries et autres particules, tout en laissant passer le coliphage. Le filtrat, riche en coliphages, est utilisé pour ensemencer une suspension d'E. Coli, que l'on laisse ensuite pousser sur une plaque d'agar gélatineuse.

Le coliphage se développe dans les cellules de E. coli et les lysent. La lyse des cellules bactériennes entraîne la formation de zones claires sur la pelouse confluente de bactéries. Ces zones claires sont appelées plaques. Chaque zone dégagée est supposée être formée par un seul coliphage.

Matériaux nécessaires:

Pipettes, fioles coniques, boîtes de Pétri, tubes à essai, tampons de coton, brûleur Bunsen, jarre jetable, centrifugeuse, appareil de filtration à membrane, chambre à flux laminaire, autoclave, incubateur, bouillon de bactériophage, gélose tryptone douce, gélose tryptone dure, culture en bouillon nutritif bactéries Escherichia coli (par exemple, E. coli B), un échantillon (par exemple, des eaux usées non traitées).

Procédure:

1. Cinq pipettes (dans un étui en acier inoxydable) et cinq boîtes de Pétri sont stérilisés dans un four à air chaud à 180 ° C pendant 3 heures. Ils peuvent aussi être recouverts de papier kraft, noués avec du fil ou une bande de caoutchouc et stérilisés dans un autoclave avec le support (Figure 8.5).

2. On pèse les ingrédients du bouillon de bactériophage ou de sa poudre prête à l'emploi, nécessaires pour 100 ml de milieu, que l'on dissout dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml et dont le pH est ajusté à 7, 6. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

3. On pèse les ingrédients du milieu gélose tryptone soft agar ou de sa poudre prête à l'emploi, nécessaires pour 100 ml de milieu, puis on les dissout dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml et on ajuste le pH à 7, 5.

4. Ce milieu liquide est réparti dans 5 tubes à essai (2 ml chacun), en coton bouché, recouverts de papier kraft et noués avec du fil ou une bande de caoutchouc.

5. Les ingrédients du milieu à la gélose tryptone dure ou de sa poudre prête à l'emploi nécessaires pour 100 ml de milieu sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml en les chauffant après ajustement du pH à 7, 5. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

6. Le ballon contenant le bouillon de bactériophages, les 5 tubes de gélose à la tryptone molle, le ballon contenant le milieu à la gélose de tryptone dure et un ballon conique vide de 250 ml bouché en coton sont stérilisés à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

7. Le milieu de gélose à la tryptone dure stérilisée dans la fiole conique est versé dans les 5 boîtes de Pétri stérilisées de manière aseptique et laissé à refroidir, de manière à obtenir 5 plaques de gélose à la tryptone dure.

8. Dans la fiole conique vide de 250 ml stérile bouchée en coton, 5 ml de bouillon de bactériophages stérilisé, 5 ml de culture de bouillon de E. coli B et 45 ml d'eaux usées brutes sont transférés de manière aseptique, de préférence dans une chambre à flux laminaire (Figure 8.6). .

9. Le ballon est mis à incuber à 37 ° C pendant 24 heures afin de permettre la prolifération du coliphage dans les eaux usées au sein des cellules de la bactérie hôte (cellules de E. coli B).

10. Le contenu du ballon est versé dans des tubes à centrifuger de 100 ml et centrifugé à 2500 tr / min pendant 20 minutes dans une centrifugeuse pour sédimenter les particules. Les sédiments sont rejetés.

11. Le surnageant, riche en coliphage, est filtré sur un appareil de filtration à membrane. Le résidu est jeté.

12. Les cinq tubes de gélose à la tryptone molle stérilisés sont prélevés et chauffés au bain-marie à 100 ° C afin de faire fondre la gélose. Les tubes sont refroidis et maintenus à 45 ° C au bain-marie.

13. À l'aide d'une pipette stérile, 1, 2, 3, 4 et 5 gouttes du filtrat sans bactéries, riche en coliphage, sont transférées de manière aseptique dans les cinq tubes de gélose à la tryptone molle.

14. Dans chaque tube de gélose à la tryptone molle, 0, 1 ml d'une culture en bouillon nutritif d'Escherichia coli B est transféré de manière aseptique.

15. Le contenu des cinq tubes de gélose molle tryptone contenant le virus, le coliphage et la bactérie E. coli B est rapidement mélangé en faisant tourner les tubes entre les paumes des mains.

16. Le contenu est versé sur les cinq plaques de gélose à la tryptone dure (étiquetées 1 à 5 gouttes), formant ainsi une préparation de culture en plaques à double couche. Les plaques tourbillonnent doucement et on les laisse durcir.

17. Les plaques inoculées sont incubées dans une position inversée à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur.

Observations:

1. Toutes les plaques sont observées pour les unités de formation de plaque (UFP) qui se développent en tant que zones claires sur la pelouse de bactéries. La formation de plaques indique la présence de coliphage dans la culture.

2. Chaque plaque représente une riche croissance de coliphage isolé.

3. Le nombre de plaques est compté dans toutes les plaques et présenté comme suit (tableau 8.1).

Tableau 8.1: Observations du nombre de coliphages :