Test d'hydrolyse lipidique sur bactéries afin de déterminer leur capacité à hydrolyser les lipides (avec figure)

Lisez cet article pour en savoir plus sur le test d'hydrolyse des lipides, afin de déterminer la capacité d'une bactérie à hydrolyser les lipides (graisses)!

Principe:

Certaines bactéries ont la capacité d'hydrolyser les lipides (graisses) en glycérol et en acides gras, car elles possèdent l'enzyme lipolytique «lipase».

Ces bactéries sont appelées bactéries lipolytiques. Tandis que les lipides forment une émulsion produisant une opacité, lorsqu'ils sont distribués dans de la gélose, leurs produits finis hydrolysés, glycérol et acides gras, ne forment pas une telle émulsion avec la gélose, pour laquelle ils ne produisent pas une telle opacité; plutôt produire de la transparence.

Dans le test d'hydrolyse lipidique, les bactéries testées sont développées sur des plaques d'agar contenant de la tributyrine comme substrat lipidique. La tributyrine forme une émulsion, lorsqu'elle est distribuée dans la gélose, produisant un milieu opaque.

Si la bactérie a la capacité d'hydrolyser les lipides, ses colonies hydrolysent la tributyrine du milieu dans les zones environnantes en glycérol soluble et acides gras (acide butyrique), tandis que le reste des zones des plaques contient de la tributyrine non hydrolysée.

De ce fait, des zones claires et transparentes se forment autour des colonies, car les produits hydrolysés, le glycérol et les acides gras, formés autour d’eux ne forment pas d’émulsion avec la gélose. D'autre part, le reste des zones des plaques reste opaque, car la tributyrine non hydrolysée dans ces zones forme une émulsion avec la gélose.

Matériaux nécessaires:

Boîtes de Pétri, fiole conique, tampons en coton, anse d'inoculation, autoclave, brûleur Bunsen, chambre à flux laminaire, bocal, incubateur, gélose de tributyrine, colonies isolées ou cultures pures de bactéries.

Procédure:

1. Deux boîtes de Pétri sont nettoyées, recouvertes de papier kraft et attachées avec du fil ou une bande de caoutchouc (Figure 7.22). Cette étape ainsi que la stérilisation des boîtes de Pétri à l'étape 6 sont omises si les boîtes de Pétri stérilisées au four sont utilisées directement.

2. Les ingrédients du milieu gélosé à la tributyrine (à l'exclusion de la tributyrine, qui est le composant lipidique) ou de sa poudre prête à l'emploi nécessaire pour 100 ml de milieu sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml en agitant tourbillonnant.

3. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 2 en utilisant HCI 0, 1 N s'il est supérieur ou à l'aide de NaOH 0, 1 N s'il est inférieur.

4. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

5. Après refroidissement à environ 90 ° C, la tributyrine est ajoutée et émulsifiée dans un mélangeur Warring.

6. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

7. Les deux boîtes de Pétri et la fiole conique contenant le milieu d'agar à la tributyrine sont stérilisées à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

8. Après la stérilisation, ils sont sortis de l'autoclave et laissés à refroidir pendant un certain temps, sans laisser le milieu se solidifier. Le refroidissement du fluide empêche la condensation et l’accumulation de gouttelettes d’eau à l’intérieur des plaques. Si le support a déjà été préparé et solidifié pendant le stockage, il doit être liquéfié en chauffant soigneusement jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

9. Pour préparer les boîtes de gélose à la tributyrine, avant de refroidir et de solidifier le milieu à la gélose de tributyrine stérilisé à chaud, il est versé de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, dans les deux boîtes de Pétri stérilisées (environ 20 ml chacune), de sorte le milieu fondu recouvre complètement le fond des boîtes de Pétri.

Ensuite, les plaques sont recouvertes de leurs couvercles et laissées à refroidir, afin de solidifier le milieu en eux. La tributyrine forme une émulsion, lorsqu'elle est distribuée dans de la gélose, produisant un milieu opaque. La vapeur d'eau susceptible de se condenser sur la surface intérieure des plaques et des couvercles est évaporée en maintenant les plaques et les couvercles en position inversée dans un incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure.

10. Chaque assiette est marquée sur le côté inférieur en quatre quarts.

11. L'inoculation localisée des bactéries à tester est réalisée de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, au centre de chaque quartier, en effectuant une tache (ou un petit frottis) de la bactérie à l'aide d'une boucle stérilisée à la flamme. La boucle est stérilisée après chaque inoculation.

12. Les plaques inoculées sont incubées en position inversée, de haut en bas, à 37 ° C pendant 24 à 48 heures dans un incubateur jusqu'à ce que des colonies de la bactérie soient visibles.