Test Ortho-Nitrophenyl Galactoside sur des bactéries pour déterminer leur capacité à hydrolyser Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside

Lisez cet article pour en savoir plus sur les performances du test Ortho-Nitrophenyl Galactoside sur des bactéries afin de déterminer leur capacité à hydrolyser Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside!

Principe:

Certaines bactéries ont la capacité de fermenter le lactose. Ils sont appelés «bactéries fermentant le lactose» ou «fomenteurs de lactose».

Les autres, qui ne peuvent pas fermenter le lactose, sont appelées bactéries «lactose non fermentantes» ou «lactose non fomentantes».

Les bactéries qui fermentent le lactose peuvent produire deux enzymes, à savoir la "permease" et la "β-galactosidase", qui sont impliquées dans la fermentation du lactose. La perméase aide à l'entrée du lactose dans les cellules bactériennes, tandis que la β-galactosidase hydrolyse le lactose en glucose et en galactose, la β-galactosidase est une enzyme inductible intracellulaire, dont la production est induite par la présence de lactose dans l'environnement des cellules de la bactérie.

Alors que les bactéries qui fermentent le lactose peuvent produire à la fois la perméase et la β-galactosidase, les bactéries ne fermentant pas le lactose ne peuvent pas produire de perméase, mais peuvent ou non produire de la β-galactosidase. Le test ONPG est effectué pour déterminer l'aptitude des bactéries non fermentantes au lactose à produire de la β-galactosidase.

Pour cela, la membrane cellulaire des cellules bactériennes non fermentantes au lactose est dissoute par addition de toluène, de manière à libérer toutes les enzymes intracellulaires, y compris la P-galactosidase, si elles sont présentes. L'enzyme, la β-galactosidase, hydrolyse le substrat orthonitrophényl-β-D-galctoside (ONPG) en orthonitrophénol, de couleur jaune.

Dans le test d'ortho-nitrophényl galactoside (test ONPG), la bactérie à tester est cultivée sur des pentes inclinées à la gélose de fer et au sucre (gélose TSI) contenant du lactose. Si les bactéries sont du lactose non fermenté, comme indiqué par le mégot rouge et l'inclinaison rouge, une suspension épaisse de la bactérie est préparée dans une solution saline, à laquelle est ajouté du toluène suivi d'une solution d'ONPG. Si la bactérie a la capacité de produire l'enzyme P-galactosidase, la couleur de la suspension bactérienne passe au jaune.

Matériaux nécessaires:

Tubes à essai, fiole conique, bouchons en coton, anse d'inoculation, aiguille d'injection, autoclave, brûleur Bunsen, chambre à flux laminaire, bocal, incubateur, gélose TSI, toluène, o-nitrophényl-β-D-galactoside (ONPG), solutions, colonies isolées ou des cultures pures de bactéries.

Procédure:

1. Les ingrédients du milieu gélose TSI (contenant les 3 sucres et le fer comme composants principaux) ou de sa poudre prête à l'emploi nécessaire pour 100 ml de milieu sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml. secouant et tourbillonnant (figure 7.16).

2. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 4 en utilisant HCI 0, 1 N s'il est supérieur ou à l'aide de NaOH 0, 1 N s'il est inférieur.

3. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

4. Avant de se solidifier, le milieu à l'état fondu et chaud est réparti dans 5 tubes à essai (environ 20 ml chacun).

5. Les éprouvettes sont en coton bouché, recouvertes de papier kraft et nouées avec du fil ou une bande de caoutchouc.

6. Ils sont stérilisés à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

7. Après la stérilisation, ils sont sortis de l'autoclave et maintenus dans une position inclinée pour refroidir et solidifier le milieu, de manière à obtenir une inclinaison de la gélose TSI.

8. Les bactéries à tester sont inoculées de manière aseptique, de préférence dans une chambre à flux laminaire, dans les pentes en coupant à l'aide d'un couteau dans le mégot et en laissant des stries sur la surface des pentes à l'aide d'une aiguille stérilisée à la flamme. L'aiguille est stérilisée après chaque inoculation.

9. Les pentes inoculées sont incubées à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur.

10. Si la bactérie est un fermenteur de lactose, elle n'est pas sélectionnée pour le test ONPG. Si la bactérie est du lactose sans fermenteur, comme indiqué par le mégot rouge et l’inclinaison rouge, elle est sélectionnée pour le test ONPG.

11. Dans un tube à essai contenant 0, 25 ml de solution saline, une culture épaisse de la bactérie est introduite au moyen d'une boucle stérilisée à la flamme, de manière à former une suspension épaisse de la bactérie.

12. Une goutte de toluène est ajoutée, mélangée et incubée pendant 5 minutes à 37 ° C.

13. Une solution de 0-nitrophényl galactoside (solution ONPG) est ajoutée et incubée à 37 ° C pendant 30 minutes. Ensuite, le changement de couleur est observé. De nouveau, le changement de couleur est observé après 24 heures.

Observations:

1. Couleur jaune produite: ONPG positif.

2. Reste incolore: négatif ONPG.