Test de l'oxydase sur les bactéries pour déterminer leur capacité à hydrolyser la gélatine en produisant de la gélatinase

Test de l'oxydase sur les bactéries pour déterminer leur capacité à hydrolyser la gélatine en produisant de la gélatinase!

Principe:

Certaines bactéries ont la capacité d'hydrolyser la gélatine, car elles peuvent produire l'enzyme protéolytique «gélatinase».

Alors que la gélatine est précipitée par le chlorure mercurique, ce qui produit une translucidité, ses produits finis hydrolysés ne sont pas précipités par le chlorure mercurique, pour lequel ils ne produisent pas une telle translucidité, mais plutôt par transparence.

Dans le test de gélatinisation, les bactéries à tester sont développées sur des plaques d'agar contenant de la gélatine. Une fois que les colonies de bactéries sont visibles, les plaques sont immergées dans une solution de chlorure de mercure. Si les bactéries ont la capacité d'hydrolyser la gélatine, ses colonies hydrolysent la gélatine dans le milieu dans les zones les entourant, tandis que les autres zones des plaques conservent la gélatine non hydrolysée.

En conséquence, lorsque des solutions de chlorure de mercure sont inondées, des zones claires transparentes se forment autour des colonies, car les produits hydrolysés formés autour de ces colonies ne forment pas de précipités avec le chlorure de mercure. D'autre part, le reste des zones des plaques devient translucide, car la gélatine non hydrolysée dans ces zones forme des précipités avec du chlorure de mercure.

Matériaux nécessaires:

Boîtes de Pétri, fiole conique, tampons en coton, anse inoculante, autoclave, brûleur Bunsen, chambre à flux laminaire, bocal, étuve, incubateur, gélose Fraaser, gélatine, solution de chlorure mercurique, colonies isolées ou cultures pures de bactéries.

Procédure:

1. Deux boîtes de Pétri sont nettoyées, recouvertes de papier kraft et attachées avec du fil ou une bande de caoutchouc (Figure 7.20). Cette étape ainsi que la stérilisation des boîtes de Pétri à l'étape 6 sont omises, si des boîtes de Pétri stérilisées au four sont utilisées directement

2. Les ingrédients du milieu de gélatine gélatine Fraizer (contenant la gélatine comme composant principal) ou de sa poudre prête à l'emploi nécessaire pour 100 ml de milieu sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation par tourbillonnement .

3. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 2 en utilisant HCI 0, 1 N s'il est supérieur ou à l'aide de NaOH 0, 1 N s'il est inférieur.

4. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

5. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

6. Les deux boîtes de Pétri et la fiole conique contenant le milieu gélose à la gélatine de Fraizer sont stérilisées à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

7. Après la stérilisation, ils sont sortis de l'autoclave et laissés à refroidir pendant un certain temps sans laisser le milieu se solidifier. Le refroidissement du fluide empêche la condensation et l’accumulation de gouttelettes d’eau à l’intérieur des plaques. Si le support a déjà été préparé et solidifié pendant le stockage, il doit être liquéfié en chauffant soigneusement jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

8. Pour préparer les boîtes de gélose à la gélatine, avant de refroidir et de solidifier à chaud le milieu gélose à la gélatine de Frazier stérilisé, on le verse de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, dans les deux boîtes de Pétri stérilisées (environ 20 ml chacune). que le milieu fondu recouvre complètement le fond des boîtes de Pétri.

Ensuite, les plaques sont recouvertes de leurs couvercles et laissées à refroidir, afin de solidifier le milieu en eux. La vapeur d'eau susceptible de se condenser sur la surface intérieure des plaques et des couvercles est évaporée en maintenant les plaques et les couvercles en position inversée dans un incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure.

9. Chaque plaque est marquée sur le côté inférieur en quatre quarts.

10. L'inoculation localisée des bactéries à tester est réalisée de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, au centre de chaque quartier en effectuant une tache (ou un petit frottis) de la bactérie à l'aide d'une boucle stérilisée à la flamme. La boucle est stérilisée après chaque inoculation.

11. Les plaques inoculées sont incubées en position inversée, de haut en bas, à 37 ° C pendant 24 à 48 heures dans un incubateur jusqu'à ce que des colonies de la bactérie soient visibles.

12. Les plaques sont immergées dans une solution de chlorure de mercure (HgCl ₂ ).

Observations:

Zones claires transparentes formées autour des colonies de bactéries: Gélatinase positive.

Zones claires transparentes non formées autour des colonies de bactéries: Négatif à la gélatinase.