Progrès récents dans le diagnostic du paludisme

Progrès récents dans le diagnostic du paludisme - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Introduction:

En Inde, le paludisme est un problème de santé majeur. il y a eu des épidémies fréquentes dans le Rajasthan et les États du nord-est. Au Rajasthan, l'incidence de P. falciparum est en augmentation. À Delhi, P. vivax est l'espèce la plus commune, mais on rencontre également P. falciparum. Le paludisme, un problème mondial, tue entre 1, 5 et 2, 7 millions de personnes chaque année. En d'autres termes, il tue une personne (souvent un enfant de moins de 5 ans) toutes les 12 secondes. En outre, 300 à 500 millions de personnes sont infectées chaque année.

Pour le contrôle de la maladie, un diagnostic rapide et précis est le plus important. Le diagnostic du paludisme n’est souvent posé que sur la base des symptômes cliniques bien que son exactitude soit au mieux de 50%. De nouvelles techniques de diagnostic avancées sont maintenant disponibles. Les investigations récemment fondées sur les tests immunologiques sont rapides (<10 min / test) et au moins aussi sensibles que la microscopie traditionnelle.

Microscopie optique: frottis sanguins épais et fins:

La procédure de laboratoire traditionnellement acceptée pour le diagnostic du paludisme est l’examen microscopique des frottis de sang colorés au Giemsa ou sur le terrain. Idéalement, le sang devrait être prélevé à l'aide d'une piqûre au doigt; Cependant, le sang obtenu par ponction veineuse et anticoagulant (EDTA ou héparine) est acceptable s'il est examiné immédiatement. Des frottis épais et minces doivent être effectués. Un frottis épais, concentre les globules rouges 20 à 30 fois sur une petite surface, augmente la sensibilité de la technique et est bien meilleur que les frottis minces. Le frottis mince est cependant plus spécifique.

C'est la norme de référence reconnue en matière de diagnostic, mais elle nécessite beaucoup de travail et l'interprétation des résultats nécessite une expertise considérable, notamment dans les cas de faible parasitémie. De plus, les parasites P falciparum qui sont souvent séquestrés loin du sang périphérique peuvent facilement être omis.

Quantification des parasites par examen des frottis sanguins:

Il existe de nombreuses méthodes pour quantifier les parasites du paludisme dans les frottis épais. Les niveaux de parasites peuvent également être quantifiés par l'examen d'un frottis sanguin mince. Un inconvénient majeur des frottis épais est qu’il nécessite souvent un certain degré d’expertise qui peut ne pas être disponible.

En théorie, l'examinateur devrait compter les champs à frottis épais contenant 20 leucocytes / hpf ou plus. En réalité, les champs contenant 20 leucocytes ou plus sont trop épais pour être comptés, alors que les champs les plus faciles à lire sont ceux qui ne contiennent que cinq ou six leucocytes / hpf.

Avant de colorer, l'examinateur doit pouvoir lire les impressions sur un frottis sanguin épais et bien préparé. L'examen des frottis minces est dix fois moins sensible que celui des frottis épais. Ainsi, même si l’examen des frottis sanguins est acceptable en tant que «standard de référence» universel, il n’existe en réalité aucune méthode standard unique, utilisée par tous les chercheurs, pour quantifier les parasites en comptant leurs parasites dans des frottis épais.

En outre, faute de personnel qualifié, le manque de microscopes limite l'utilité de l'examen du frottis sanguin dans de nombreuses zones d'endémie. Reconnaissant ces limites, des techniques alternatives pour le diagnostic du paludisme ont été développées.

Microscopie Fluorescente:

Trois techniques fluorescentes sont prometteuses pour le diagnostic du paludisme.

Ceux-ci sont:

(i) La méthode quantitative de buffy-coat (OBC) disponible sous forme de kit commercial

ii) le procédé Kawamoto Acridine Orange (AO) et

(iii) Procédure à la benzothiocarboxypurine (BCP).

Ces trois techniques sont rapides et faciles à exécuter. quand il y a plus de 100 parasites / µL, ils démontrent une sensibilité et une spécificité équivalentes à celles obtenues avec un examen par frottis épais.

Les méthodes OBC et Kawamoto utilisent l’Ocridine Orange (AO) comme fluorochrome pour la coloration des acides nucléiques des parasites du paludisme dans un échantillon. Le BCP est également un fluorochrome, qui colore les acides nucléiques. AO est non spécifique et colore les acides nucléiques de tous les types de cellules.

Par conséquent, l'examinateur doit apprendre à distinguer les parasites colorés par fluorescence des autres cellules et des débris cellulaires. La sensibilité de la coloration AO avec des niveaux de parasite inférieurs à 100 parasites / µL a été comprise entre 41, 7 et 93%.

La spécificité de la coloration AP pour P. vivax et P. falciparum est respectivement de 52 et 93%. La méthode BCP a une sensibilité et une spécificité de plus de 90%. Une limitation importante des méthodes basées sur l'AO et le BCP est leur incapacité à différencier les espèces de Plasmodium. L'AO est dangereux et nécessite des exigences d'élimination particulières.

OBC et le BCP sont techniquement plus exigeants que Kawamoto. Les méthodes Kawamoto et AO nécessitent un équipement et des fournitures spéciaux et sont plus onéreuses. Le prix d'un microscope à fluorescence pourrait constituer un facteur limitant pour les laboratoires intéressés à utiliser ces méthodes.

Détection de séquences spécifiques d’acides nucléiques:

La détection de séquences d’acides nucléiques spécifiques aux parasites Plasmodium peut être utile. Dans les techniques basées sur la PCR, la séquence cible amplifiée est détectée par des sondes internes ou analysée par électrophorèse sur gel. L’avantage majeur de l’utilisation d’une technique basée sur la PCR est la capacité de détecter une «parasitémie basse». Les infections par des parasites vivants peuvent être détectées avec une spécificité de 100%.

Cependant, ces techniques sont coûteuses et exigent beaucoup de main-d’œuvre, nécessitent une vaste expertise technique, impliquent de multiples étapes et ne peuvent pas être utilisées pour distinguer les organismes viables des autres.

Les inhibiteurs de la PCR naturellement présents dans les échantillons de sang peuvent entraîner un nombre important de résultats faux négatifs. Des résultats faussement positifs, dus à la contamination par report, ont également été enregistrés.

Des techniques basées sur la PCR ont été utilisées pour dépister les donneurs dans une région où le paludisme est endémique. La sensibilité et la spécificité des méthodes basées sur la PCR, estimées à l'aide de l'examen du frottis sanguin comme «étalon de référence», sont toutes égales ou supérieures à 90%.

En outre, les progrès de la technologie de la PCR pourraient bientôt permettre de distinguer les parasites viables des virus non viables. A l'heure actuelle, l'utilité de cette technologie est limitée par le besoin en équipements de laboratoire coûteux et spécialisés, par un personnel formé aux technologies génétiques et dans les installations de salles blanches, ainsi que par le coût élevé des enzymes et des amorces utilisées.

Détection d'antigène:

Les tests de détection des anticorps antipaludiques étaient limités en sensibilité et en capacité de distinguer les infections antérieures des infections actives. Les tests de capture d'antigène de la nouvelle génération sont capables de détecter moins de parasites et de produire des résultats rapides (10-15 min). Ce sont des kits disponibles dans le commerce, qui incluent tous les réactifs nécessaires et ne nécessitent pas de formation ni d’équipement importants.

Deux nouveaux antigènes parasitaires sont utilisés dans le nouveau test rapide de diagnostic, l’histidine-riche protein 2 (HRP-2), produite uniquement par P. falciparum et l’antigène parasite lactate déshydrogénase (pLDH), produite par les quatre espèces de plasmodium infectant l'homme. Les deux antigènes sont sécrétés dans le sang par tous les stades asexués du parasite; l'antigène pLDH est également produit par les gamétocytes.

Les derniers tests de capture d’antigène sont rapides et simples à réaliser et ont des limites de détection comparables à celles de la microscopie de haute qualité (100 à 200 parasites / µL). Lorsqu'il existe plus de 60 à 100 parasites / µL, le test HRP- 2 tests basés sont très sensibles (> 90%) et spécifiques (> 90%), par rapport à la microscopie à frottis épais.

Actuellement, deux tests de ce type sont disponibles dans le commerce, le test ParaSight F et le test ICT (immunochromatographique) Malaria Pf. Les deux tests sont effectués sur des échantillons de piqûre au doigt et ne détectent que le paludisme à P. falciparum.

Ils sont basés sur des anticorps monoclonaux dirigés contre la HRP-2, immobilisés sur des bandes de nitrocellulose, afin de produire des bandelettes réactives ou des tests sur carton (ICT Pf Test). Dans chaque test, un résultat positif est indiqué par l’apparition d’une ligne rouge sur la bandelette de test, où les anticorps monoclonaux sont immobilisés.

Les deux tests contiennent également un contrôle intégré; une ligne de contrôle doit apparaître pour qu'un test soit considéré comme valide. La sensibilité et la spécificité du test ParaSight F sont respectivement de 88 et 97%, comparables à celles de la PCR.

Bien que les tests sérologiques basés sur HRP-2 aient permis un diagnostic rapide du paludisme à falciparum, leur utilité est limitée. Comme HRP-2 n'est présent que chez P. falciparum, les tests basés sur la détection de HRP-2 sont négatifs avec une infection causée par vivax, ovale ou paludisme.

Par conséquent, de nombreux cas de paludisme non falciparum seront diagnostiqués à tort comme négatifs. Une autre limite des tests basés sur HRP-2 est que HRP-2 persiste dans le sang longtemps après que les symptômes cliniques ont disparu et que les parasites ont apparemment été éliminés de l'hôte.

En fait, HRP-2 a été découvert chez des momies. Les tests de dépistage de cet antigène peuvent donc ne pas être utiles pour dépister les populations indigènes des zones d’endémie susceptibles de présenter une parasitémie persistante de faible intensité. La raison possible de la persistance de l’antigène HRP-2 n’est pas bien comprise; elle peut refléter la présence de parasites viables latents (pouvant résulter d'un échec du traitement) ou de complexes antigène-anticorps solubles.

La persistance peut également dépendre du type de traitement antipaludique mis en place. Le signal HRP-2 peut persister 19 jours après un traitement apparemment efficace à la quinine et à la doxycycline. Une antigénémie persistante de HRP-2 a également été observée pendant et après le traitement par l'artéméther.

D'autres limitations sont spécifiquement liées aux aspects techniques du système HRP-2. Par exemple, les IgG monoclonales utilisées dans le système ParaSight F peuvent provoquer une réaction croisée avec le facteur rhumatoïde et provoquer une réponse faussement positive.

Le test ICT Pf utilise un IgM monoclonal, qui ne réagit pas de manière croisée et il n'y a pas de rapports de réactions faussement positives survenant avec ce test en raison du facteur rhumatoïde. Le test ICT Pf nécessite toutefois un stockage à 4 ° C, ce qui limite son utilité sur le terrain.

Essais sérologiques basés sur le pLDH:

Les tests sérologiques rapides les plus récents pour le diagnostic du paludisme reposent sur la détection de la pLDH. Comme les tests basés sur HRP-2, ces tests sont sensibles, spécifiques et faciles à réaliser, les résultats pouvant être obtenus en moins de 15 minutes.

Les analyses à base de pLDH permettent également de différencier P. falciparum des autres espèces de Plasmodium et, comme elles ne sont produites que par des parasites viables, elles sont également utiles pour surveiller le traitement antipaludique. La pLDH de P. falciparum se différencie de la LDH de l'hôte (h-LDH) par le 3-acétylpyridine adénine dinucléotide (APAD), un analogue du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD).

Les tests à base de pLDH sont disponibles sous deux formes: une jauge sèche, semi-quantitative, (OptiMAL); et un dosage quantitatif de capture immuno-enzymatique. Le test OptiMAL utilise deux anticorps monoclonaux, l'un spécifique à P. falciparum et l'autre reconnaissant les 4 plasmasmodes.

L’échantillon de sang testé (10 µL de piqûre au doigt, de sang total ou d’hémolysat congelé) est mélangé à 3o µL de tampon de lyse contenant l’anticorps monoclonal conjugué. On laisse ce mélange pénétrer dans la jauge OptiMAL.

Au bout de 3 minutes, 100 µL de tampon de clarification sont ajoutés. Si P. falciparum est présent dans l'échantillon de sang, trois lignes (dont une au sommet de chaque bâtonnet représentant le contrôle positif) se développent sur des bandelettes réactives.

Deux lignes indiquent P. vivax, P. malariae ou occasionnellement, P. ovale. Une bandelette OptiMAL-2 nouvellement formatée comporte trois lignes de test et une ligne de contrôle positif, ce qui permet d'identifier les quatre espèces de Plasmodium.

Chaque test est considéré comme ualid uniquement si une ligne de contrôle se développe. Les anticorps monoclonaux utilisés dans le test OptiMAL ont fait l’objet de tests approfondis de réactivité croisée avec la LDH provenant de leishmanies, de babesia et de bactéries ou champignons pathogènes, et aucune preuve d’une telle réactivité croisée n’a été trouvée.

HRP-2 persiste bien après l'élimination de la parasitémie périphérique. Bien que les taux de pLDH suivent de près la parasitémie périphérique et tombent à des valeurs indétectables 3 à 5 jours après le traitement à la quinine et à la doxycycline, les taux d’antigène HRP-2 ne chutent qu’après 19 jours, bien après que le patient présente des symptômes et semble être exempt de parasites.

Le dosage OptiMAL devrait donc être un outil précieux dans la surveillance du traitement antipaludique. La clairance de la parasitémie et la clairance de la pLDH semblent être parallèles.

Les dosages OptiMAL sont très polyvalents. Le test OptiMAL présente des sensibilités respectives de 94 - 88% et une spécificité de 100 et 99% pour P. vivax et P. falciparum, respectivement, par rapport aux frottis sanguins.

Ce test peut être utilisé comme un outil épidémiologique car, dans les zones où circulent plus d’une espèce de Plasmodium, il peut être utilisé pour identifier rapidement l’espèce Plasmodium infectant des patients dans chaque village et permettre aux agents de santé publique d’administrer la chimiothérapie la plus appropriée. .

Conclusions:

Au cours des dernières années, les efforts visant à remplacer la lecture traditionnelle et fastidieuse des frottis sanguins (méthode mise au point il y a près de 100 ans) ont abouti à la mise au point de techniques de détection des parasites du paludisme qui ont une sensibilité équivalente ou supérieure à la microscopie.

Bien que les méthodes basées sur la PCR soient sans doute les plus sensibles, elles sont si coûteuses et nécessitent un équipement et une formation spécialisés tels qu'il est peu probable qu'elles soient utilisées pour le diagnostic de routine dans la plupart des pays en développement.

Ils sont particulièrement utiles pour les études sur les différences de souches, les mutations et les gènes impliqués dans la pharmacorésistance du parasite, et pour montrer le niveau de corrélation entre les souches associées à différents foyers de paludisme. Les nouveaux tests de diagnostic du paludisme les plus prometteurs sont les bandelettes réactives sérologiques.

Ces tests, y compris ParaSight F, ICT Pf Test et OptiMAL, sont simples à utiliser, faciles à interpréter et produisent des résultats en 15 minutes ou moins. Ces tests sont presque aussi sensibles que l'examen microscopique des frottis sanguins, mais ne nécessitent pas de personnel hautement qualifié pour effectuer ou interpréter les résultats.

Le test OptiMAL présente l’avantage supplémentaire de pouvoir détecter les quatre espèces de Plaspiodium et de suivre l’efficacité des traitements médicamenteux, car il mesure une enzyme produite uniquement par des parasites vivants.

Bien que les bandelettes réactives présentent deux limites évidentes, elles ne devraient pas non plus empêcher ces tests d’être largement acceptés. La première limitation est celle de la sensibilité. Les trois tests actuellement commercialisés ont des seuils de sensibilité de 50-100 parasites / µ1. La sensibilité des échantillons avec <50 parasites / µL est toujours comprise entre 50% et 70%.

Ce niveau de sensibilité peut ne pas poser trop de problème aux personnes vivant de manière permanente dans des zones d’endémie, qui ne reçoivent souvent pas de traitement sauf si elles ont plus de 500 parasites / µL de sang, mais peuvent poser un problème de diagnostic du paludisme chez les individus sont originaires de zones non endémiques mais vivent, travaillent ou voyagent dans des zones endémiques.

Cependant, comme la grande majorité des patients atteints de paludisme ont des niveaux de parasites bien supérieurs à 50 parasites / µL, peu de patients seraient mal diagnostiqués si les bandelettes réactives étaient systématiquement utilisées. La deuxième limite de ces tests, du moins à l’heure actuelle, est leur coût.

L'Organisation mondiale de la santé considère que, pour les personnes vivant dans des zones d'endémie, les tests de diagnostic du paludisme devraient coûter moins de 0, 40 USD / échantillon. À moins que les tests de jauge ne soient produits en grand nombre, ce prix est inaccessible et difficile à satisfaire pour les fabricants.

Les coûts actuels des tests de bandelettes réactives dépendent de la localisation de l'acheteur et du volume commandé. Par exemple, le coût des tests ICT Pf varie de 1, 30 USD / test dans les pays en développement. Les tests du Para 0Sight F se vendent à 1, 20 USD / test. La bande optiMAL se vend actuellement à 3, 00 USD / test.