Essai d'hydrolyse de l'amidon sur des bactéries pour déterminer leur capacité à hydrolyser l'amidon

Test d'hydrolyse de l'amidon sur bactéries afin de déterminer leur capacité à hydrolyser l'amidon!

Principe:

Certaines bactéries ont la capacité d'hydrolyser l'amidon, car elles peuvent produire l'enzyme saccharolytique.

Alors que l’amidon forme une couleur bleu foncé avec de l’iode, ses produits finis hydrolysés n’acquièrent pas cette couleur bleu foncé avec de l’iode.

Dans le test d'hydrolyse de l'amidon, les bactéries à tester sont cultivées sur des plaques d'agar contenant de l'amidon. Une fois que les colonies de bactéries sont visibles, les plaques sont inondées d'une solution d'iode. Si les bactéries ont la capacité d'hydrolyser l'amidon, ses colonies hydrolysent l'amidon dans le milieu dans les zones les entourant, tandis que le reste des zones des plaques contient de l'amidon non hydrolysé.

En conséquence, lorsqu’elles sont inondées de solution d’iode, des zones claires transparentes se forment autour des colonies, car les produits hydrolysés formés autour d’eux ne forment pas de couleur bleu foncé avec l’iode. D'autre part, le reste des zones des plaques devient bleu foncé, car l'iode forme une couleur bleu foncé avec l'amidon non hydrolysé dans ces zones.

Matériaux nécessaires:

Boîtes de Pétri, fiole conique, tampons en coton, anse d'inoculation, autoclave, brûleur Bunsen, chambre à flux laminaire, bocal, étuve, incubateur, gélose à l'amidon, solution d'iode de Lugol, colonies isolées ou cultures pures de bactéries.

Procédure:

1. Deux boîtes de Pétri sont nettoyées, recouvertes de papier kraft et attachées avec du fil ou une bande de caoutchouc (Figure 7.21). Cette étape ainsi que la stérilisation des boîtes de Pétri à l'étape 6 sont omises, si des boîtes de Pétri stérilisées au four sont utilisées directement.

2. Les ingrédients du milieu gélose à l'amidon (contenant de l'amidon en tant que composant principal) ou de sa poudre prête à l'emploi requise pour 100 ml de milieu sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation et tourbillonnement.

3. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 2 en utilisant HCI 0, 1 N s'il est supérieur ou à l'aide de NaOH 0, 1 N s'il est inférieur.

4. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

5. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

6. Les deux boîtes de Pétri et la fiole conique contenant le milieu de gélose à l'amidon sont stérilisées à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

7. Après la stérilisation, ils sont sortis de l'autoclave et laissés à refroidir pendant un certain temps, sans laisser le milieu se solidifier. Le refroidissement du fluide empêche la condensation et l’accumulation de gouttelettes d’eau à l’intérieur des plaques. Si le support a déjà été préparé et solidifié pendant le stockage, il doit être liquéfié en chauffant soigneusement jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

8. Pour préparer les boîtes de gélose à l'amidon, avant de refroidir et de solidifier le milieu de gélose à l'amidon stérilisé, on le verse de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, dans les deux boîtes de Pétri stérilisées (environ 20 ml chacune). le milieu fondu recouvre complètement le fond des boîtes de Pétri.

Ensuite, les plaques sont recouvertes par leurs couvercles et laissées à refroidir, de manière à solidifier le support en eux. La vapeur d'eau susceptible de se condenser sur la surface intérieure des plaques et des couvercles est évaporée en maintenant les plaques et les couvercles en position inversée dans un incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure.

9. Chaque plaque est marquée sur le côté inférieur en quatre quarts.

10. L'inoculation localisée des bactéries à tester est réalisée de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, au centre de chaque quartier en effectuant une tache (ou un petit frottis) de la bactérie à l'aide d'une boucle stérilisée à la flamme. La boucle est stérilisée après chaque inoculation.

11. Les plaques inoculées sont incubées en position inversée, de haut en bas, à 37 ° C pendant 24 à 48 heures dans un incubateur jusqu'à ce que des colonies de la bactérie soient visibles.

12. Les plaques sont inondées de solution d'iode de Lugol.