Test à l'uréase sur les bactéries pour déterminer leur capacité à hydrolyser l'urée (avec figure)

Test de l'uréase sur les bactéries pour déterminer leur capacité à hydrolyser l'urée (avec figure)!

Principe:

Certaines bactéries ont la capacité d'hydrolyser (décomposition en présence d'eau) l'urée en NH ₃ et en CO ₂, car elles peuvent produire l'enzyme «uréase».

Le NH ₃ est alcalin (basique), ce qui augmente le pH en changeant la couleur du rouge phénol du jaune au rose.

Dans le test à l'uréase, les bactéries à tester sont cultivées sur des géloses inclinées contenant de l'urée et du rouge de phénol. Si les bactéries ont la capacité d'hydrolyser l'urée, la couleur du milieu passe du jaune au rose. Certaines bactéries peuvent produire du NH ₃ en décomposant les peptones dans le milieu. Dans de tels cas, un résultat faux positif est obtenu.

Matériaux nécessaires:

Tubes à essai, fiole conique, tampons en coton, aiguille à inoculer, autoclave, brûleur Bunsen, chambre à flux laminaire, bocal, incubateur, appareil de filtration sur membrane, agar à l'urée, colonies isolées ou cultures pures de bactéries.

Procédure:

1. Cinq éprouvettes sont en coton bouché, recouvertes de papier kraft et nouées avec du fil ou une bande de caoutchouc (Figure 7.15).

2. Les ingrédients du milieu gélose à l'urée (contenant principalement de l'urée) ou de sa poudre prête à l'emploi (à l'exception de l'urée) requise pour 100 ml de milieu sont pesés et dissous dans 90 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml. secouant et tourbillonnant.

3. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 6, 9 en utilisant HCl 0, 1 N s'il est supérieur ou en utilisant NaOH 0, 1 N s'il est inférieur.

4. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

5. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

6. Les cinq éprouvettes et la fiole conique contenant de la gélose à l'urée (à l'exception de l'urée) sont stérilisées à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

7. Après la stérilisation, ils sont sortis de l'autoclave et laissés à refroidir pendant un certain temps sans laisser le milieu se solidifier. Le refroidissement du fluide empêche la condensation et l’accumulation de gouttelettes d’eau sur les pentes. Si le support a déjà été préparé et solidifié pendant le stockage, il doit être liquéfié en chauffant soigneusement jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

8. Une solution d'urée à 20% est préparée en dissolvant 20 grammes d'urée dans 100 ml d'eau distillée et est stérilisée à l'aide d'un appareil de filtration à membrane, car l'urée ne peut pas être stérilisée à la chaleur, car elle se décompose lors du chauffage.

9. On mélange aseptiquement 10 ml de la solution d'urée stérilisée avec 90 ml du milieu liquéfié refroidi stérilisé (liquéfié par chauffage).

10. Avant de se solidifier, le milieu à chaud et fondu est réparti de manière aseptique dans les 5 éprouvettes stérilisées en coton tamponné (environ 20 ml chacune).

11. Les éprouvettes sont maintenues dans une position inclinée pour refroidir et solidifier le milieu, de manière à obtenir une inclinaison de la gélose à l'urée.

12. Les bactéries à tester sont inoculées de manière aseptique, de préférence dans une chambre à flux laminaire, dans les pentes en coupant à l'aide d'un couteau dans le mégot et en laissant des stries sur la surface des pentes à l'aide d'une aiguille stérilisée à la flamme. L'aiguille est stérilisée après chaque inoculation.

13. Les pentes inoculées sont incubées à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur.