Méthodes d'analyse par immunoabsorbant lié à une enzyme (ELISA) pour détecter l'antigène

Méthodes d'analyse par immunoabsorbant lié à une enzyme (ELISA) pour détecter l'antigène!

Une méthode d'immunoabsorbant lié à une enzyme peut être utilisée pour détecter un antigène ou un anticorps. La méthode ELISA présente de nombreux avantages par rapport aux autres méthodes (tableau 27.2).

La méthode ELISA est 10 à 1000 fois plus sensible que les méthodes plus anciennes telles que l’agglutination et l’immunoélectrophorèse. Une variété de modifications de ELISA sont disponibles, dont certaines sont décrites ici.

Tableau 27.2: Avantages des tests immunologiques enzymatiques

1. L’effet d’amplification des enzymes conduit à la mise au point d’essais plus sensibles

2. Les réactifs ont une longue durée de vie et sont relativement bon marché

3. Une grande variété de configurations de test peut être développée

4. L'équipement est moins coûteux et disponible largement

5. Aucun risque de radiation

6. Peut être effectué dans de petits laboratoires également

ELISA pour doser les anticorps:

L'antigène connu est déposé sur une microplaque (petite plaque en plastique, traitée pour maximiser la liaison aux protéines; contient 96 puits d'un volume de 200 µl).

↓

Le sérum humain de test est ajouté au puits et incubé.

je. Si le sérum contient des anticorps contre l'antigène revêtu, ceux-ci se lient aux antigènes.

↓

Les puits sont lavés pour éliminer les composants sériques non liés.

↓

Une immunoglobuline anti-humaine conjuguée à une enzyme (appelée conjugué) est ajoutée aux puits et incubée.

ii. Le conjugué se lie aux anticorps liés à l'antigène dans le puits.

iii. Si le sérum à tester ne contient pas d'anticorps contre l'antigène, le conjugué reste dans la solution.

↓

Les puits sont lavés pour éliminer le conjugué non lié.

↓

Un substrat approprié est ajouté aux puits et incubé.

iv. L'enzyme du conjugué dans le complexe antigène-anticorps-conjugué agit sur le substrat et fend le substrat pour produire un produit coloré. Le développement de la couleur indique que l'anticorps spécifique de l'antigène appliqué sur les puits est présent dans le sérum à tester.

v. Le non développement de couleur indique que le sérum à tester ne contient pas d'anticorps contre l'antigène enduit sur les puits.

↓

Une solution d'arrêt (généralement de l'acide sulfurique IN) est ajoutée pour arrêter la réaction. Ensuite, la plaque est conservée dans un lecteur ELISA et la densité optique (DO) des puits est mesurée. La DO correspond à la quantité d'anticorps dans le sérum à tester.

En utilisant des concentrations connues d'anticorps, un graphique peut être construit. Les concentrations d'anticorps sont tracées sur l'axe des X et les DO correspondantes sont tracées sur l'axe des Y et une courbe est dessinée. En interpolant la valeur DO du sérum à tester, la concentration en anticorps dans un sérum à tester est déterminée.

ELISA pour doser l'antigène:

Un anticorps monoclonal connu (appelé anticorps primaire) dirigé contre un antigène est appliqué sur les puits de microtitration.

↓

L'échantillon supposé contenir l'antigène est ajouté au puits et incubé.

je. Si l'échantillon contient l'antigène correspondant, l'antigène se lie à l'anticorps présent sur le puits et forme un complexe antigène-anticorps.

↓

Les puits sont lavés pour éliminer les matériaux non liés.

↓

Un mAb conjugué à une enzyme connu (appelé conjugué) contre l'antigène est ajouté aux puits et la plaque est incubée.

je. Si le puits contient un complexe antigène-anticorps, le conjugué se lie à l'antigène présent dans le complexe.

ii. S'il n'y a pas de complexe antigène-anticorps, le conjugué reste en solution.

↓

Les puits sont lavés pour éliminer le conjugué non lié. Un substrat approprié est ajouté et incubé.

je. S'il y a du conjugué dans le puits, l'enzyme du conjugué divise le substrat et produit un produit coloré.

iii. L'absence de développement de couleur indique qu'il n'y a pas d'antigène dans l'échantillon (contre l'anticorps appliqué sur les puits).

↓

Une solution d'arrêt est ajoutée pour arrêter la réaction. Les OD des puits individuels sont lus dans le lecteur ELISA. Comme expliqué précédemment, un graphique (constitué de différentes concentrations d'antigènes sur l'axe des X et des valeurs de densité correspondantes sur l'axe des Y) est construit et la courbe est dessinée. La concentration de l'antigène dans l'échantillon à tester est déterminée par interpolation de sa densité optique.

Méthode ELISA de capture d'anticorps:

Les puits de la microplaque de titrage sont recouverts d'anticorps anti-IgM humains.

↓

Le sérum du patient est ajouté et incubé. Les anticorps IgM dans le sérum se lient aux anticorps anti-IgM humains des puits.

Les puits sont lavés puis un antigène connu est ajouté et incubé.

je. Si des anticorps IgM contre l'antigène sont présents dans le puits, l'antigène se liera à l'anticorps IgM et restera dans le puits.

↓

Les puits sont lavés pour éliminer l'antigène non lié

↓

Un mAb conjugué à l'enzyme et à l'antigène est ajouté et incubé.

je. Si l'antigène est présent dans le puits (complexe anti-IgM-IgM-antigène), le conjugué se lie à l'antigène.

↓

Les puits sont lavés pour éliminer le conjugué non lié et du substrat est ajouté.

je. Le développement de la couleur indique que des anticorps IgM contre l'antigène sont présents dans le sérum du patient.

ii. Le non développement de la couleur indique que le sérum du patient ne contient pas d'anticorps IgM contre l'antigène.

↓

La solution d'arrêt est ajoutée et les DO des puits sont mesurées individuellement dans le lecteur ELISA. La quantité d'anticorps IgM dirigés contre l'antigène peut être déterminée en traçant un graphique tel que décrit précédemment.

Une procédure similaire peut être adoptée pour détecter des anticorps IgG dirigés contre un antigène.

Les enzymes couramment utilisées dans les techniques ELISA sont la peroxydase de raifort et la phosphatase alcaline (tableau 27.3). Ces enzymes sont couplées de manière covalente à des AcM. Ces enzymes agissent sur divers substrats pour produire des produits colorés. Comme la dernière étape de la méthode ELISA est enzymatique, la méthode ELISA est extrêmement sensible (c’est-à-dire que de très faibles concentrations d’antigène ou d’anticorps sont détectables).

La sensibilité des tests ELISA est améliorée en utilisant des réactifs supplémentaires (par exemple, dosage de biotine / immuno-immunodosage). Récemment, l'utilisation de substrats de peroxydase de raifort, qui produisent des produits chimiluminescents, a encore accru la sensibilité. La mesure de la vitesse de la réaction, plutôt que de l'ampleur de la réaction à un seul instant fixe, donne des résultats quantitatifs ELISA plus précis.

Tableau 27.3: Caractéristiques des enzymes utilisées dans les essais immunologiques enzymatiques:

ELISA amélioré par biotine-avidine:

Au lieu de marquer le mAb avec une enzyme, le MAb peut être marqué avec de la biotine (vitamine B ₁₂ ).

↓

Ensuite, l'enzyme marquée avidine (un composant protéique du blanc d'œuf) est ajoutée.

↓

L'avidine se lie à la biotine avec une très grande sensibilité et affinité. Ensuite, le substrat est ajouté. Le complexe enzymatique (dans le complexe mAb-biotine-avidine-enzyme) agit sur le substrat et produit un produit coloré.

L'amélioration de la biotine-avidine est également utilisée dans les dosages immuno-fluorescents.

Dosage immunoenzymatique par microparticules:

Au lieu de recouvrir les puits de la plaque de microtitrage d'antigènes ou d'anticorps, de petites billes (1 mm de diamètre) sont recouvertes d'antigène ou d'anticorps et des dosages ELISA sont réalisés. Les microparticules offrent une plus grande surface pour le revêtement d'antigène ou d'anticorps, ce qui permet de recouvrir des concentrations plus élevées d'antigène ou d'anticorps, ce qui contribue à raccourcir le temps requis pour les réactions de liaison.

Le dosage immunoenzymatique fluorescent est identique aux autres tests immunoenzymatiques, à la différence qu’ils utilisent des substrats fluorescents. Dans l'EIA fluorescent, le fluorophore est généré par une réaction enzymatique. Suite à l'excitation du fluorophore à sa longueur d'onde optimale, une lumière à une longueur d'onde caractéristique est émise. La lumière fluorescente émise est mesurée.

Fluoroimmunoessai résolu dans le temps:

Cette méthode nécessite une instrumentation spéciale et des étiquettes fluorescentes spéciales pour augmenter la sensibilité du test. Le marqueur fluorescent utilisé dans cet essai présente une fluorescence retardée avec une période de temps de 100 ns ou plus entre l'excitation et l'émission. La plupart des substances responsables de la fluorescence de fond ont une courte période de décroissance. Par conséquent, la mesure du signal de fluorescence retardée réduira les effets de la fluorescence de fond.

Cet objectif est atteint grâce à l'utilisation d'un fluoromètre spécial à résolution temporelle qui produit une impulsion lumineuse rapide qui excite le fluorophore. La fluorescence est mesurée peu de temps après l'excitation. Ainsi, l'effet de fond non spécifique, qui se désintègre généralement en moins de 10 ns, peut être éliminé.

Les fluorophores présentant une fluorescence retardée sont:

je. Dérivés du pyrène avec un temps de chute de presque 100 ns.

ii. Les marqueurs de chélates de métaux de terres rares [tels que l'europium (Eu ³⁺ ), le samarium (Sm ³⁺ ) et le terbium (Tb ³⁺ )] présentent un temps de désintégration très long, de 50 à 100 µs environ.

Dosage immunologique chimiluminescent:

Les dosages immunologiques chimioluminescents (CL-EIA) utilisent des substrats chimioluminescents qui réagissent avec diverses enzymes. La réaction substrat-enzyme chimioluminescente génère une lumière semblable à la bioluminescence. Les systèmes d’EIE chimioluminescents constituent une nette amélioration par rapport aux AIR, en termes de sensibilité, de rapidité et de simplicité des procédures.

Les dosages immunologiques de chimiluminescence utilisent des molécules générant une chimiluminescence comme marqueurs.

je. Dérivés Luminol

ii. Acridinium esters

iii. Dérivés d'oxalate de nitrophényle

iv. Ruthenium tri-bipridyle avec de la tripropylamine pour l'électrochimiluminescence

v. Fondamentalement, les méthodes de test ne diffèrent pas des RIA / FIA.