Tests de la fonction neutrophile
Tests de la fonction neutrophile!
1. La chimiotaxie des neutrophiles peut être évaluée par les méthodes suivantes:
une. Essai de chambre de Boyden modifié:
La chambre de Boyden est composée d'une chambre supérieure et d'une chambre inférieure séparées par un filtre à petites pores.
La suspension de neutrophiles est placée dans la chambre supérieure et une substance chimiotactique est placée dans la chambre inférieure. L'étendue de la migration des neutrophiles est évaluée en comptant le nombre de neutrophiles piégés dans le filtre et le nombre de neutrophiles dans la chambre basse par cytométrie en flux.
b. Les puits sont percés dans une gélose semi-solide:
Une suspension de neutrophiles, une substance chimiotactique et une substance non chimiotactique sont placés dans des puits différents. La migration des cellules à travers la gélose semi-solide vers le puits contenant la substance chimiotactique est déterminée au microscope. La migration vers la substance non chimiotactique représente bien le mouvement aléatoire des cellules (connu sous le nom de chimiocinèse).
2. Phagocytose des neutrophiles:
Une variété de particules peut être utilisée pour évaluer la capacité phagocytaire des neutrophiles. Les particules sont incubées avec des neutrophiles et ensuite observées au microscope pour la présence des particules à l'intérieur des neutrophiles. Les particules liées à la surface des cellules sont éliminées avec un traitement acide, de sorte que les particules liées à la surface des cellules ne sont pas comptées comme des particules intracellulaires.
Des particules marquées fluorescentes ou radioactives permettant un comptage direct des particules par les phagocytes sont également disponibles.
3. Détermination de l'éclatement respiratoire et de la dégranulation:
La maladie granulomateuse chronique (CGD) est une maladie d'immunodéficience dans laquelle la destruction intracellulaire par les phagocytes est affectée en raison de l'incapacité des cellules phagocytaires à produire un anion superoxyde (O 2 - ).
une. Test sur lame de nitroblue tétrazolium (NBT):
Le NBT est un colorant clair, jaune, soluble dans l'eau. Le NBT est réduit à un bleu profond, le formazon par O 2 - . Les neutrophiles sont activés par traitement au PMA ou exposition au LPS. Les neutrophiles activés sont ensuite incubés avec du NBT. Si les neutrophiles produisent de l'O 2 -, le NBT est réduit au formazon bleu foncé et il est visualisé au microscope. Un dosage quantitatif peut être effectué en extrayant le formazon des neutrophiles et en le dosant à l'aide d'un spectrophotomètre. Les enfants présentant une déficience complète de l'activité de la NADPH oxydase présentent une déficience globale dans le test NBT. Mais les enfants présentant une perte partielle d'activité de la NADPH oxydase sont mieux détectés par un dosage quantitatif.
b. Test cytométrique en flux utilisant la 2'7′-dichloro-fluorescéine (DCF):
L'enzyme O 2 - formée pendant l'activité de la NADPH oxydase est convertie en H 2 O 2 par l'enzyme superoxyde dismutase. H 2 O 2 est un autre produit chimique microbicide. H 2 O 2 oxyde le composé non fluorescent DCF en un composé fluorescent, qui est détecté par le cytomètre en flux.
Les phagocytes sont incubés avec du DCF et le DCF entre dans les cellules.
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Ensuite, les neutrophiles sont activés par PMA ou d'autres agents.
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Ensuite, les cellules sont analysées dans le cytomètre en flux. Une augmentation de la fluorescence des phagocytes est déterminée.
Le cytomètre de flux permet également la détermination quantitative de H 2 O 2 produite par des cellules individuelles. Par conséquent, l'analyse cytométrique en flux est utile pour la détection de défauts partiels de la fonction NADPH oxydase ou pour le dépistage de porteurs hétérozygotes de la forme liée à l'X de la CGD.
4. dégranulation des phagocytes:
La dégranulation phagocytaire est un processus de fusion de lysosomes avec des phagosomes, conduisant à la décharge du contenu lysosomal dans le phagolysosome. La dégranulation est un processus actif et nécessite de l'énergie. L'altération des voies métaboliques normales des neutrophiles (en particulier la consommation d'oxygène et le métabolisme métabolique du glucose via le shunt hexose monophosphate) interfère avec la dégranulation; par conséquent, la destruction intracellulaire des microbes par les phagocytes est affectée.
La dégranulation des phagocytes en suspension peut être induite par divers agents d'activation et composés agissant sur le cytosquelette de la cellule (telle que la cytochalasine B). Les phagocytes libèrent principalement les granules secondaires et tertiaires et ils sont mesurés par des méthodes ELISA.
je. La lactoferrine (un granule de neutrophiles secondaire) est utilisée comme marqueur de la libération de granules secondaires.
ii. L'albumine est analysée en tant que mesure de la libération de granules tertiaires.
Le dosage de la libération des granules primaires par les phagocytes est effectué en recherchant la libération des granules primaires dans des espaces clos. La «phagocytose frustrée» est un test utilisé pour évaluer la libération de granules primaires (Fig. 27.7).
Des immunoglobulines ou des complexes immuns agrégés thermiquement sont fixés à un petridish.
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Les neutrophiles sont ajoutés au petridish et incubés. Par leurs récepteurs Fc, les neutrophiles se lient aux régions Fc des immunoglobulines ou des complexes immuns agrégés par la chaleur. En conséquence, les neutrophiles tentent de phagocyter les complexes immuns d'immunoglobuline ou d'agrégats de chaleur. Mais les neutrophiles ne peuvent pas les phagocyter (car ils sont fixés à la boîte de Pétri). Par conséquent, les neutrophiles libèrent leur contenu granulaire sur eux.
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La vitesse de libération des protéines granulaires primaires, telles que la myéloperoxydase ou la β-glucoronidase, est utilisée pour estimer la dégranulation. Des déficiences dans la synthèse de granules primaires / secondaires peuvent également être détectées en colorant des granules intracellulaires avec des AcM marqués et une cytométrie en flux.
Élimination des bactéries par les neutrophiles:
Les dosages microbicides sont difficiles à réaliser. En règle générale, les analyses microbicides sont effectuées lorsque des analyses plus simples ne fournissent pas suffisamment d'informations.
La souche 502A de Staphylococcus aureus est couramment utilisée pour évaluer la capacité microbicide des neutrophiles.
La souche 502A de Staphylococcus aureus en croissance en phase logarithmique est incubée avec des sérums humains (pour fournir des protéines d'immunoglobuline et du complément qui jouent le rôle d'opsonines).
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Des neutrophiles fraîchement isolés sont ajoutés à une concentration de 5-10 bactéries / neutrophiles.
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Après 30 minutes d'incubation, les bactéries qui ne sont pas englouties par les neutrophiles sont tuées par l'addition du médicament gentamicine. (Gentamidn n'entre pas dans les neutrophiles et la bactérie phagocytée reste donc vivante.)
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Des aliquotes de neutrophiles sont prélevées toutes les 30 minutes et mélangées à de l'eau distillée stérile pour lyser les neutrophiles et libérer les bactéries. Le nombre de bactéries viables dans chaque aliquote est mesuré par dilution en série et étalement sur des plaques de gélose au sang.
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Les résultats sont tracés sur un graphique.
je. Les neutrophiles normaux montrent une réduction de deux log chez les bactéries intracellulaires viables après une heure d'incubation.
ii. Les neutrophiles de patients homozygotes atteints de CCD ne meurent pratiquement pas.
iii. Les neutrophiles des porteurs de CGD hétérozygotes montrent une destruction partielle par les neutrophiles.
