Western blot de protéines
Western Blot of Proteins!
Les protéines sont dénaturées par incubation avec un détergent ionique (SDS: sodium dodecyl sulfate) à 100 ° C.
Le SDS enrobe uniformément toutes les protéines et rend la charge de surface des protéines négative.
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La protéine dénaturée est ensuite soumise à une électrophorèse dans un gel de polyacrylamide. Les protéines sont séparées en bandes distinctes en fonction de leur poids moléculaire.
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Les protéines séparées sont transférées par électrophorèse sur un papier filtre (nylon ou nitrocellulose).
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Le papier filtre est ensuite incubé avec des antisérums contre les protéines. Les anticorps se lient aux antigènes protéiques correspondants sur le papier filtre et forment des complexes antigène-anticorps.
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Le papier filtre est lavé pour éliminer les composants sériques non liés.
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Un anti-immunoglobuline marqué par une enzyme (connu sous le nom de conjugué) est ajouté au papier filtre et incubé.
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Le conjugué se lie à l'anticorps dans le complexe antigène-anticorps du papier filtre.
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Le papier filtre est lavé pour éliminer le conjugué non lié et le substrat est ajouté et incubé.
je. Des bandes colorées se développent aux endroits où se trouvent des complexes antigène-anticorps.
iii. Le non développement de la bande suggère que l'anticorps correspondant contre l'antigène est absent du sérum à tester.
Les papiers filtres imprégnés d'antigènes peuvent être conservés plus longtemps.
Le test Western blot est largement utilisé pour détecter les anticorps du virus de l'hépatite C et comme test de confirmation pour la détection des anticorps dirigés contre le virus de l'immunodéficience humaine (VIH).
Les entreprises commerciales imprègnent des papiers filtres d'antigènes du VIH séparés et les fournissent aux laboratoires. En laboratoire, le sérum du patient est ajouté au papier filtre et traité pour détecter la présence d'anticorps spécifiques du VIH dans le sérum.
Dosage radioimmunologique:
Le dosage radioimmunologique (RIA) a été développé pour la première fois par Rosalin Yalow et Berson (1959). De nombreuses variantes de la méthode ont été introduites. Il existe deux techniques principales d'AIR, l'AIR concurrentielle et l'ARI non concurrentielle.
Différents radio-isotopes sont utilisés comme marqueurs (tableau 27.4) et les émissions radioactives sont mesurées en termes de comptages par minute (CPM) à l'aide d'un compteur à scintillation. La plus répandue des étiquettes, la 125 I, nécessite un temps de comptage des signaux plus court, mais sa durée de vie en magasin est limitée en raison de sa courte demi-vie. Le radio-isotope au tritium ( 3 H) nécessite un temps de comptage plus long, ce qui augmente le temps total de dosage.
Les avantages de RIA sont:
je. Précision et haute qualité
ii. La conjugaison isotopique est facile
iii. Détection de signal sans optimisation
Tableau 27.4: Propriétés des radio-isotopes utilisés en dosage radioimmunologique:
Isotope | Demi vie | Type de décomposition | Activité spécifique (mCi / µmol) |
125 I | 60 jours | γ | 2200 |
131 I | 8.1 jours | Β-, γ | 16 100 |
3 h | 12, 3 ans | β- | 29 |
14 C | 5760 ans | β- | 6062 |
32 p | 14.3 jours | β- | 9120 |
Cependant, RIA présente les inconvénients suivants
je. Demi-vie courte des réactifs
ii. Risques de radioactivité.
