Vise à isoler différentes bactéries présentes dans un échantillon donné et à maintenir leurs cultures pures

Vise à isoler différentes bactéries présentes dans un échantillon donné et à maintenir leurs cultures pures.

Objectif:

Les bactéries présentes dans la nature ne se présentent pas comme des espèces séparées, mais plutôt comme des populations mixtes de différentes espèces.

Par conséquent, pour étudier les différentes espèces de bactéries, il faut d’abord les séparer de la population mixte. Ce processus s'appelle «l'isolement des bactéries».

Pour ce faire, la population mélangée de bactéries à la surface d'un milieu solide se transforme en colonies distinctes. Les «colonies» sont des masses individuelles, macroscopiquement visibles, de bactéries développées à la surface d'un milieu solide, chacune représentant la multiplication d'une bactérie unique.

Comme chaque colonie provient de la croissance et de la multiplication répétée d'une seule bactérie, toutes les bactéries présentes dans la colonie appartiennent à la même espèce. Ainsi, chaque colonie représente une très grande population d'une seule espèce de bactérie.

Ces colonies sont transférées de manière aseptique pour séparer les pentes de la gélose nutritive et y être développées. Les espèces de bactéries isolées, cultivées séparément sur des inclinaisons d'agar sont appelées «cultures pures». Tous les 15 à 30 jours, ils sont transférés sur des pentes fraîches afin de ne pas perdre leurs caractéristiques d'origine en raison d'une surpopulation, d'un manque de nutriments et d'une accumulation de métabolites.

De cette manière, des cultures pures de bactéries sont maintenues dans le laboratoire par transfert répété sur des pentes fraîches à intervalles réguliers. Ce processus est appelé «maintien de la culture pure». Les cultures pures sont conservées en laboratoire pour leur identification ultérieure par diverses techniques de coloration, biochimiques, sérologiques et moléculaires, ainsi que pour leur utilisation future.

Les «cultures mères» sont des cultures pures standard, dont l'identification est établie au niveau des genres, espèces, sous-espèces, types ou sous-types. Ils sont conservés dans des laboratoires de microbiologie de renommée internationale.

D'autres laboratoires peuvent les obtenir de ces laboratoires et les conserver dans leurs propres laboratoires, en les transférant de manière répétée sur des pentes fraîches à intervalles réguliers. Ils sont utilisés pour l'identification confirmée des cultures pures obtenues dans ces laboratoires en comparant leurs caractéristiques avec celles des cultures mères standard.

Principe:

La population mélangée de bactéries présentes dans un matériau donné (solide, liquide ou de surface) est cultivée sur des plaques de gélose nutritive par la méthode de la plaque étalée ou de la plaque à streak, comme décrit précédemment dans la section «Culture de bactéries». Chaque colonie isolée trouvée sur une plaque d'agar consiste en une espèce de bactérie, chaque colonie se développant à partir d'une bactérie unique.

Ainsi, les bactéries sont isolées sur des plaques de gélose selon deux techniques:

a) Technique de la plaque de propagation

b) Technique de la plaque à stries

Des colonies représentatives (colonies ayant des caractéristiques différentes) sont sélectionnées et inoculées de manière aseptique pour séparer les angles de gélose afin d'obtenir les cultures pures. Tous les 15 à 30 jours, ils sont transférés sur des pentes fraîches pour le maintien de ces cultures pures.

Matériaux nécessaires:

Tubes à essai (5 n °), fiole conique de 250 ml (1 non), NaOH 0, 1 N, HCl 0, 1 N, eau distillée, gélose nutritive, coton non absorbant, boucle, papier kraft, fil (ou élastique), papier pH (ou pH-mètre), brûleur Bunsen, autoclave, chambre à flux laminaire, incubateur, plaques contenant des colonies isolées de bactéries (plaque étalée ou plaque striée).

Procédure:

1. Les ingrédients du milieu gélose nutritive ou de sa poudre prête à l'emploi, nécessaires pour 100 ml de milieu, sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation et tourbillonnement (figure 6.4).

2. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 0 avec HC1 0, 1 N s'il est supérieur ou avec NaOH 0, 1 N s'il est inférieur.

3. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

4. Avant de se solidifier, le milieu à l'état fondu et chaud est réparti dans 5 tubes à essai (environ 20 ml chacun).

5. Les éprouvettes sont en coton bouché, recouvertes de papier kraft et nouées avec du fil ou une bande de caoutchouc.

6. Ils sont stérilisés à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

7. Après la stérilisation, ils sont sortis de l'autoclave et maintenus en position inclinée pour refroidir et solidifier le milieu. Ces éprouvettes contenant du milieu de gélose nutritive solidifiée en position inclinée sont appelées «gélose de gélose nutritive».

8. Les étapes 10 et 11 doivent être effectuées selon une technique aseptique, de préférence dans une chambre à flux laminaire. La bouche des récipients contenant des milieux ou des cultures stérilisés doit être indiquée sur la flamme du bec Bunsen après avoir retiré le bouchon en coton et avant de le remettre en place.

Les boucles, avant utilisation, doivent être stérilisées à la flamme en les chauffant au rouge puis en les refroidissant pendant 30 secondes pour les ramener à la température ambiante. Ils ne doivent jamais être utilisés lorsqu'ils sont très chauds, car ils tuent les microbes en les touchant.

9. Dans l'expérience précédente, si des colonies isolées pouvaient être observées sur une plaque étalée ou une plaque striée, cinq colonies présentant des caractéristiques différentes seraient sélectionnées comme colonies représentatives.

10. Une boucle est stérilisée à la flamme et une boucle de bactéries de chacune des colonies représentatives est prélevée de manière aseptique. La boucle est introduite dans l'inclinaison de la gélose, de sorte que la boucle de la bactérie aille jusqu'au bout de l'inclinaison. La boucle est déplacée vers l’extérieur de manière ondulée et touche la surface de l’inclinaison, de sorte à former une ligne ondulée.

11. La boucle est stérilisée à la flamme et, de la même manière, le reste des quatre colonies représentatives est inoculé séparément dans la gauche sur quatre pentes. La boucle est stérilisée après chaque inoculation.

12. Les cinq échantillons d'inoculation sont incubés à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur.

Observations (caractéristiques culturelles):

(i) Une ligne ondulée avec une croissance sur toute sa longueur observée:

La croissance a eu lieu.

L'inclinaison est observée pour les caractéristiques d'inclinaison comme suit (Figure 6.5).

1. Abondance de croissance:

La quantité de croissance est désignée par aucune, légère, modérée ou grande.

2. pigmentation:

Les microorganismes chromogènes peuvent produire des pigments intracellulaires qui sont responsables de la coloration de l’organisme, comme on le voit dans les colonies de surface. D'autres organismes produisent des pigments solubles extracellulaires qui sont excrétés dans le milieu et produisent également une couleur. Cependant, la plupart des organismes ne sont pas chromomériques et paraîtront blancs à gris.

3. Caractéristiques optiques:

Les caractéristiques optiques peuvent être évaluées sur la base de la quantité de lumière transmise par la croissance.

Ces caractéristiques sont décrites comme suit:

(une) Opaque: Pas de transmission de la lumière.

(b) Translucide: Transmission partielle de la lumière.

4. forme:

L’apparence de la ligne simple de croissance sur la surface de la gélose est désignée comme suit:

(une) Filiforme: Croissance continue, filiforme, à bords lisses.

(b) Echinulate: Croissance continue, filiforme, à bords irréguliers.

(ré) Effusion: croissance mince et étendue.

e) Arborescente: croissance semblable à un arbre.

(f) Rhizoïde: croissance ressemblant à une racine.

ii) Pas de croissance le long de la ligne d'inoculation:

Technique d'inoculation défectueuse, l'inoculation est répétée. Dénombrement des bactéries.

C. Dénombrement des bactéries:

L'étendue de l'activité bactérienne dans un échantillon donné dans un ensemble défini de conditions dépend principalement du nombre total de bactéries présentes dans celui-ci, quelle que soit leur espèce. Par conséquent, il est très souvent nécessaire de connaître le nombre total de bactéries présentes dans les échantillons d'aliments, d'eau, de sol, d'air et de tissus au cours de leur analyse microbiologique.

L'estimation du nombre de bactéries dans un échantillon donné s'appelle «dénombrement de bactéries». Il existe différentes méthodes de dénombrement des bactéries, indiquées ci-dessous. Toutes ces méthodes nécessitent la présence de bactéries dans une suspension homogène.

C’est pourquoi on suppose que les échantillons liquides sont des suspensions homogènes de bactéries et qu’ils sont directement utilisés, tandis que les échantillons solides sont homogénéisés dans des solutions salines stériles afin d’obtenir des suspensions homogènes de bactéries.

Non utilisé couramment:

(I) Méthodes directes:

(a) Comptage microscopique direct

b) Compteur de cellules électronique

(II) Méthodes indirectes:

c) Méthodes chimiques

(ré) Méthode turbidimétrique

e) Nombre de filtres à membrane

Le plus largement utilisé:

f) Méthode de placage sur gélose avec dilution en série ou méthode de dénombrement sur plaque totale (méthode TPC)

(a) Comptage microscopique direct:

Dans cette méthode, le nombre de bactéries présentes dans une partie aliquote de la suspension homogène de bactéries est compté directement au microscope et le nombre total de bactéries dans l’échantillon est déterminé mathématiquement.

L'avantage de cette méthode est que c'est très rapide. Les inconvénients sont que les cellules vivantes (viables) et mortes sont comptées et que la méthode n’est pas sensible aux populations de moins d’un million de bactéries par millilitre.

Le comptage peut être effectué de deux manières:

i) Chambre Petroff-Hauser:

Il s'agit d'une chambre de comptage spécialisée dans laquelle une fraction aliquote de la suspension homogène de bactéries est placée pour le comptage directement au microscope.

ii) Frottis de race:

Les cellules bactériennes sont directement comptées au microscope en utilisant des frottis colorés confinés à une zone de 1 mm ² sur la lame. Il est principalement utilisé pour le dénombrement des bactéries dans le lait.

b) Compteur de cellules électronique:

Un compteur de cellules électronique tel que «compteur Coulter» permet de compter directement le nombre de cellules bactériennes. Une suspension homogène de cellules bactériennes préparées dans un fluide conducteur est autorisée à passer à travers un minuscule orifice, traversé par un courant électrique.

La résistance à l'orifice est enregistrée électroniquement. Lorsqu'une cellule, non conductrice, traverse l'orifice, la résistance augmente momentanément. Le nombre de fois où la résistance augmente momentanément est enregistré électroniquement, ce qui indique le nombre de bactéries présentes dans la suspension.

L'avantage de cette méthode est qu'elle est extrêmement rapide. Les inconvénients sont que les cellules vivantes (viables) et mortes sont comptées et que l'instrument ne peut pas faire la distinction entre les cellules bactériennes et les particules inertes.

c) Méthodes chimiques:

Ces méthodes estiment la quantité de ces substances, principalement des produits chimiques, qui augmente avec l’augmentation de la population bactérienne.

Les principaux paramètres estimés sont les suivants:

(i) Concentration en protéines

(ii) concentration en ADN

(iii) poids sec

iv) Production de dioxyde de carbone

(v) absorption d'oxygène

vi) Production d'acide lactique

d) Méthode turbidimétrique:

Lorsque les bactéries se développent dans un milieu liquide riche en nutriments (par exemple, un bouillon nutritif), leur croissance abondante rend le milieu trouble, car les cellules de la bactérie y restent en grande partie en suspension. La turbidité augmente avec l'augmentation du nombre de cellules dans le support. Au fur et à mesure que la turbidité augmente, "l'absorbance" ou la "densité optique (DO)" du support augmente.

La DO de la suspension de cellules bactériennes dans le milieu est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à 600 nm. Le nombre de cellules bactériennes dans la suspension est déterminé en comparant la DO à une courbe standard préparée en traçant les valeurs de DO pour différentes concentrations connues de bactéries. La méthode est rapide mais limitée aux suspensions bactériennes de plus de 10 millions de cellules.

(e) Nombre de filtres à membrane:

Cette méthode est utilisée lorsque le nombre de bactéries dans un échantillon liquide est très inférieur. Pour augmenter la concentration de bactéries, l'échantillon liquide est d'abord filtré de manière aseptique à travers un appareil de filtration à membrane stérilisé utilisant un filtre à membrane stérile.

Le filtre à membrane contenant les bactéries piégées est transféré de manière aseptique dans une boîte de Pétri stérile contenant un tampon absorbant saturé d'un milieu liquide différentiel sélectif. Le milieu suinte sur la surface du filtre. Après incubation, le nombre de colonies formées sur le filtre est compté à l'aide d'un simple microscope.