Coloration des bactéries par des spores afin de différencier les cellules bactériennes et les spores bactériennes

Objectif:

Toutes les bactéries restent dans leurs «formes végétatives» si les conditions environnementales sont favorables à leurs activités métaboliques normales.

Sous cette forme, ils absorbent les nutriments, grandissent et se reproduisent.

D'autre part, la plupart d'entre eux meurent lorsque les conditions environnementales deviennent défavorables: froid intense, chaleur extrême, vieillissement, manque de nutriments, exposition aux radiations et produits chimiques toxiques.

Cependant, peu d'espèces de bactéries peuvent survivre dans des conditions aussi défavorables en se transformant en des formes hautement résistantes et inactives du point de vue métabolique, appelées «spores». Dans des conditions défavorables, une spore est produite dans une cellule végétative par déshydratation et contraction de son contenu cellulaire.

Cette spore, formée à l'intérieur de la cellule bactérienne, s'appelle «endospore» (Figure 2.13). Si les conditions défavorables s'aggravent, la cellule se rompt, libérant l'endospore, qui devient maintenant une cellule dormante indépendante appelée «spore».

Le processus de formation des spores est appelé «sporogenèse». La spore a des couches épaisses, relativement imperméables, telles que le cortex et le revêtement des spores, qui protègent la cellule de tout dommage physique. La spore gagne sa résistance par plusieurs mécanismes, qui n'ont pas encore été clairement expliqués.

Lorsque les conditions deviennent favorables, les couches recouvrant la spore se rompent et la spore donne naissance à une cellule végétative métaboliquement active. Ce processus s'appelle la «germination».

Ainsi, en fonction de la capacité à former des spores, les bactéries peuvent être divisées en deux groupes, comme suit:

(1) Bactéries spores (spores-formers):

Une bactérie qui peut produire une spore pour survivre dans des conditions environnementales défavorables est une bactérie sporiforme (sporeuse). Généralement, les trois genres suivants de bactéries en forme de bâtonnets peuvent produire des spores dans des conditions environnementales défavorables.

A. Bactéries aérobies en forme de bâtonnets

1. Bacillus spp.

B. Bactéries anaérobies en forme de bâtonnets

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Bactéries non sporulées (non sporeuses):

Une bactérie, qui ne peut pas produire de spore et, par conséquent, meurt sous sa forme végétative dans des conditions environnementales défavorables, est une bactérie ne formant pas de spores (ne forme pas de spores).

La coloration des spores a pour but de différencier les spores et les cellules végétatives d'un agent de formation de spores et de différencier les vecteurs de spores des non-vecteurs de spores. La coloration des spores est également utile pour identifier les bactéries appartenant aux genres Bacillus, Clostridium et Desulfotomaculum.

Principe:

Les spores sont différentes des cellules végétatives en ce qu'elles sont entourées de couches épaisses, relativement imperméables (Figure 2.14). La tache principale, le vert malachite, ne peut pas pénétrer dans les spores à travers ces couches.

Par conséquent, la pénétration de la tache primaire est augmentée par l’application de chaleur qui l’entraîne à travers les couches de revêtement jusqu’au protoplaste de la spore. Maintenant, les spores apparaissent en vert. Lorsque les spores sont traitées avec l'agent de décoloration, l'eau du robinet, elles ne subissent pas de décoloration, car elles excluent l'eau.

L'eau du robinet élimine uniquement la tache primaire en excès présente autour des spores. Ainsi, les spores conservent la couleur verte. Par la suite, lorsqu'elles sont contre-colorées avec la safranine, les molécules de safranine ne peuvent pas pénétrer dans les spores à travers les couches de couverture. Ainsi, finalement, les spores conservent la couleur verte de la tache primaire et apparaissent en vert.

Par ailleurs, les cellules de bactéries végétatives absorbent facilement la coloration principale, le vert malachite, mais la coloration n’a pas une forte affinité pour les composants des cellules végétatives, ce qui lui permet d’être lavée lorsqu'elle est décolorée sous l’eau du robinet.

Maintenant, les cellules végétatives semblent incolores. Lorsqu'elles sont contre-colorées à la safranine, les cellules végétatives incolores absorbent la tache et apparaissent en rouge contrairement aux spores, qui apparaissent en vert.

Matériaux nécessaires:

Slide, loop, green malachite, safranine, bactéries sporulées, plaque chauffante, microscope, huile d’immersion.

Procédure:

1. Une lame est correctement nettoyée sous l'eau du robinet, de sorte que l'eau ne reste pas sous forme de gouttes à la surface.

2. L'eau adhérente est essuyée avec du papier absorbant et la lame est séchée à l'air.

3. Un frottis de bactéries formant des spores est effectué au centre d'une diapositive selon les deux méthodes décrites ci-dessous.

(une) Si vous devez observer une formation de spores sur une plaque d'agar ou une inclinaison d'agar, une goutte d'eau est placée au centre de la lame. Une boucle est stérilisée à la flamme et une boucle de Clostridium composée d'une bactérie d'une plaque âgée ou d'une culture inclinée (âgée de 48 à 72 heures) d'agent sporiforme, telle que Clostridium supergenes ou Bacillus subtilis est transférée dans la goutte d'eau.

Ensuite, par une légère rotation de la boucle dans la goutte d’eau, une suspension bactérienne est formée et la goutte est étalée jusqu’à obtention d’un frottis. Au fur et à mesure que les bactéries responsables de la formation de spores sur des cultures sur plaques ou en pente augmentent, elles forment des spores.

(b) Si l'on souhaite observer un agent de formation de spores cultivé dans un bouillon liquide, la culture en bouillon, ne contenant que des cellules végétatives, est soumise à un stress thermique, par chauffage au bain-marie pendant 15 minutes, de sorte qu'une partie des cellules végétatives forme des spores pour surmonter le problème. stress thermique. Une goutte de la suspension cellulaire mixte spore-végétative issue de la culture en bouillon est directement placée au centre de la lame par une boucle stérile et un frottis est effectué par étalement.

4. Le frottis est séché à l'air.

5. Le frottis est fixé par chauffage. Le chauffage entraîne la coagulation des protéines cellulaires, grâce à quoi les cellules adhèrent à la surface de la lame et ne sont pas lavées lors de la coloration. La fixation à la chaleur se fait en passant rapidement la lame au-dessus d'une flamme 2 à 3 fois, avec le frottis. surface tournée vers le haut, de sorte que le frottis ne soit pas échauffé.

6. Le frottis est inondé avec la tache principale, le vert malachite.

7. La lame est maintenue sur une assiette chaude et la préparation laissée à la vapeur pendant 2-3 minutes. La température de la plaque chauffante est tellement ajustée que la préparation ne bout pas et s’évapore rapidement. La perte par évaporation est reconstituée afin que le frottis ne se dessèche pas.

8. La lame est retirée de la plaque chauffante et refroidie.

9. Le frottis est décoloré en le lavant avec de l'eau du robinet qui coule doucement, de manière à ce que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

10. Le frottis est recouvert de safranine pendant 30 secondes.

11. L'excès de contre-tache est complètement éliminé du frottis sous l'eau du robinet, de telle sorte que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

12. La lame est essuyée avec du papier absorbant.

13. La lame est fixée sur la platine du microscope et le frottis est observé sous des objectifs de faible puissance et de forte sec.

14. Une goutte d'huile d'immersion est appliquée sur le frottis.

15. Le frottis est observé sous l'objectif d'immersion dans l'huile.