Top 3 des étapes séquentielles de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
Les points suivants mettent en évidence les trois principales étapes séquentielles de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Les étapes séquentielles sont les suivantes: Dénaturation 2. Annelage 3. Extension de l’ADN.
Etape Séquentielle N ° 1. Dénaturer:
La première étape consiste à dénaturer l'ADN (à la fois l'ADN de l'amorce et l'ADN natif). La séparation de deux brins d'ADN est appelée dénaturation, tandis que le rapprochement de deux peuplements est appelé ré-annelage ou hybridation (Fig. 48.1). La découverte de la dénaturation et du recuit de l'ADN a été faite artificiellement par Marmor et Lane (1960).
Selon eux, l'ADN double brin pourrait être séparé en deux simples brins distincts (dénaturant) par chauffage à haute température (90-95 ° C) et hybridation ou jonction de deux brins d'ADN (ADN double brin), ce qui est possible par en diminuant la température (50-56 ° C).
C'est le principe principal sur lequel la PCR fonctionne. Le second principe est l'extension de l'amorce à l'aide de l'enzyme ADN polymérase.
L'ADN natif, l'amorce et l'enzyme ADN polymérase (Tag polymerase) sont ajoutés dans un tube de PCR et la température est élevée et abaissée dans la machine de PCR pour se dénaturer et s'hybrider.
Etape Séquentielle N ° 2. Annelage:
Après avoir dénaturé l'ADN, l'étape suivante consiste à permettre à l'amorce de synthèse de s'anneler sur les brins d'ADN opposés de la séquence cible souhaitée. Un recuit (hybridation) peut survenir si la température de 95 ° C est abaissée à 50/56 ° C. La température est ensuite abaissée dans la machine.
Dès que la température est abaissée, les brins d'ADN natif se lieront non seulement les uns aux autres, mais se lieront également aux amorces. Cette hybridation spécifique, ou «recombinaison» de nucléotides complémentaires, fournit à la fois la justification et la base pratique d'une grande partie de l'ADN recombinant (figure 48.2).
Etape Séquentielle N ° 3. Extension de l’ADN (l’enzyme Taq Polymerase est nécessaire):
Une fois que les amorces ont été recuites, elles doivent être étendues en utilisant l’amorce oligonucléotidique comme point d’initiation. décrit que l’enzyme ADN polymérase est nécessaire à la synthèse de l’ADN. Par conséquent, pour l'extension de l'amorce, nous avons besoin d'une ADN polymérase thermostable afin que l'enzyme ne soit pas détruite à haute température.
La polymérase thermostable (Taq polymérase) est isolée de Thermus aquaticus. La Taq polymérase présente un avantage considérable dans la réalisation de la réaction PCR. Il a une température d'activité optimale d'environ 70 ° C et aucune enzyme fraîche ne doit être ajoutée à chaque tube à essai après le processus de chauffage et de refroidissement.
L’ADN polymérase thermostable est maintenant fabriquée par différentes sociétés de sources différentes (autres que Thermus aquaticus) sous différentes dénominations commerciales (MC). Pour l'extension de l'amorce, l'ADN polymérase thermostable est ajoutée dans le tube et la température est ensuite élevée à 65-70 ° C.
Les cycles suivants de séparation de brin (dénaturation), d’hybridation d’amorce (annelage) et de synthèse de brin (extension) assurent l’amplification exponentielle des séquences cibles en utilisant la séquence amplifiée si le cycle précédent est un nouveau gabarit (Fig. 48.2). ).
Primer Making:
Les amorces sont des séquences courtes (souvent de l'ARN) sont utilisées pour fabriquer deux nucléotides, appelés amorces, avec un pour chaque extrémité du fragment d'ADN et fournissent une extrémité 3 -OH libre à laquelle une ADN polymérase commence la synthèse d'une chaîne désoxyribonucléotide.
Une séquence est faite dans le sens, tandis que l'autre est faite dans le sens anti-sens. (Fig. 48.2). L'amorce est utilisée pour amorcer la synthèse de brins d'ADN complémentaires et est conçue de telle sorte que l'ADN entre les amorces constitue le fragment d'intérêt à amplifier.
Si l'ARN messager (ARNm) est amplifié, il doit être converti en ADN complémentaire (ADNc) par une ADN polymérase dépendante de l'ARN, la transcriptase inverse. Le complexe d'ADNc est ensuite transformé en ADN double brin, devenant un gabarit pour une réaction PCR ultérieure.
Ceci est souvent connu sous le nom de réaction en chaîne de la transcriptase polymérase inversée (RT PCR). Les amorces peuvent être générées artificiellement ou peuvent être achetées auprès des entreprises.
Une fois la réaction terminée, les produits amplifiés (ADN) peuvent être visualisés par électrophorèse sur gel. La propriété physique importante de la molécule d’ADN est que chaque nucléotide possède une charge négative nette résultant du groupe phosphate.
Ainsi, des fragments de différentes tailles exposés à un champ électrique ont tendance à migrer vers l'électrode positive à un taux différent en fonction de la taille, les petits fragments migrant plus rapidement que le plus grand. Ce processus de séparation à base de charge électrique est appelé électrophorèse.
Les échantillons d'ADN, après avoir été digérés en fragments de tailles différentes par une enzyme de restriction (endonucléase), sont ajoutés au milieu support tel que le gel agrose ou l'acrylamide. Les pores du gel dépendent de son pourcentage et peuvent être comparés à un tamis (moléculaire). Ainsi, la vitesse de migration des fragments d'ADN à travers le gel dépend à la fois de la taille de fragment d'ADN et de la tension appliquée.
La procédure permettant de séparer et de déduire un fragment d’ADN spécifique est un transfert de Southern. L'importance de cette technique réside dans le fait que le fragment de simple brin peut être transféré par capillarité sur un support solide (membrane de nylon ou de cellulose) et fixé de manière permanente par chauffage (Fig. 48.3).
Après électrophorèse, le motif de l'ADN peut être visualisé sous lampe UV après traitement avec une coloration au bromure d'éthidium; le bromure d'éthidium est un colorant fluorescent. L'électrophorèse sur gel agrose a distingué des fragments de 100 paires de bases à 60000 paires de bases (60 kb) alors que les gels de Polyacrylamide séparent efficacement les fragments de 1000 paires de bases (1 kb).
L'électrophorèse sur gel d'impulsion (PFGE) a rendu possible la séparation de fragments d'ADN, même jusqu'à 2 kb. Dans cette procédure, le champ électrique est modifié dans différentes directions, forçant les molécules d'ADN à se réorienter entre chaque impulsion ou courant électrique. C'est la meilleure technique pour identifier un gène connu.
Les endonucléases peuvent reconnaître 3, 4, 5, 6 ou 8 paires de bases et sont disponibles sur le marché.
Tampons / sels de PCR.
Pour la Taq ADN polymérase, le tampon est fabriqué comme suit:
KCI 50 mM
Tris-HCl 10 mM à la température ambiante
Le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le glycol sont utilisés comme co-solvants dans les tampons PCR lorsque la cible a une température de dénaturation très élevée.
Le désoxynucléotide triphosphate (dNTP) est un cofacteur ionique.
Aujourd'hui, les sociétés de biotechnologie proposent des solutions préparées.
Le principe de base est décrit comme suit:
Il existe quatre dNTP, à savoir dATP (adénine triphosphate), dCTP (cytosine), dGTP (gunine), dUTP (uracile), utilisés conformément aux règles de la paire de bases pour étendre l’amorce et finalement pour copier la séquence cible.
Le dNTP se lie à Mg 2+ . La quantité de dNTP présente dans une réaction déterminera la quantité de Mg 2+ libre disponible pour une activité enzymatique optimale. Les solutions mères de dNTP doivent être neutralisées avec du Tris base à pH 7, 0 et leur concentration doit être déterminée par spectrophotométrie.
Substrat et Analogues de substrat:
La Taq polymérase fonctionne (dNTP) de manière très efficace. Cependant, certains substrats modifiés sont disponibles à la place du substrat Tag DNA polymerase. Ce sont la dogoxigénine-dNTP, la biotine-11-dUTP, la C7deaza-dGTP et le dNTPS marqué par fluorescence.
Les types de PCR suivants sont couramment utilisés:
(1) PCR imbriquée;
(2) RT-PCR;
(3) PCR d'ancrage;
(4) PCR asymétrique;
(5) PCR inverse;
(6) DOP-PCR.
