Expérience pour effectuer une coloration de Gram de bactéries (avec figure)

Lisez cet article pour en savoir plus sur l'expérience consistant à effectuer une coloration de Gram sur une bactérie afin de déterminer si elle est gram-positive ou gram-négative!

Objectif:

La coloration différentielle la plus importante utilisée en microbiologie est la coloration de Gram.

Il tire son nom du Dr Christian Gram, qui a classé les bactéries en deux groupes, en fonction de la composition de leur paroi cellulaire:

(1) Bactéries Gram-positives:

Après avoir coloré une bactérie avec du cristal violet, si sa paroi cellulaire résiste à la décoloration en la lavant avec un agent décolorant (éthanol ou acétone), il s’agit d’une bactérie à Gram positif. Exemples: Bacillus, Staphylococcus.

(2) Bactéries Gram-négatives:

Après avoir coloré une bactérie au violet cristallisé, si sa paroi cellulaire lui permet de se décolorer par lavage avec un agent décolorant (éthanol ou acétone), il s’agit d’une bactérie gram-négative. Exemples: Escherichia, Salmonella, Vibrio.

La différenciation des bactéries en groupes gram positif et gram négatif fournit la clé la plus importante pour aller plus loin dans l'identification des bactéries inconnues. Il est également utile pour la différenciation simple des bactéries en groupes gram positif et négatif. Cela donne également une idée de la forme et de la disposition des cellules bactériennes.

Principe:

Dans la coloration de Gram, les cellules de la bactérie sont d'abord colorées avec une coloration primaire, le violet cristallisé qui pénètre dans les cellules et les colore en violet-bleu. Ensuite, les cellules sont traitées avec un mordant, l'iode de Gram, qui pénètre dans les cellules et se lie à la tache primaire en formant un complexe colorant-mordant insoluble (complexe cristal violet-iode), ce qui rend difficile la fuite de la tache.

Ensuite, les cellules sont traitées avec un agent de décoloration, tel que l'éthanol ou l'acétone. Il agit en tant que solvant lipidique et en tant qu’agent de déshydratation des protéines. Dans les cellules à Gram positif, l'agent de décoloration agit initialement comme un solvant lipidique, en dissolvant la faible quantité de lipide présent dans la paroi cellulaire, formant ainsi de minuscules pores. Ensuite, il déshydrate les protéines de la paroi cellulaire (peptides), qui ferment les pores.

Maintenant, le complexe de coloration est difficile à éliminer par l'agent décolorant et les cellules conservent la couleur bleu pourpre de la tache primaire. La safranine, lorsqu'elle est contrecollée par une tache de couleur rose-rouge, ne peut pas pénétrer dans les cellules, car les pores ont été fermés.

Les cellules conservent finalement la couleur bleu-violet de la tache primaire. D'autre part, la paroi cellulaire gram-négative contient une grande quantité de lipides (LPS), qui est dissoute par l'agent décolorant, ce qui entraîne la formation de pores dilatés. Ces pores ne se ferment pas sensiblement lors de la déshydratation des protéines de la paroi cellulaire.

C'est pourquoi; le complexe colorant-mordant s'échappe par les pores lorsqu'il est lavé par l'agent décolorant et les cellules deviennent incolores. Lorsqu'il est contre-coloré par la safranine, il pénètre dans les cellules par les pores et finalement, les cellules prennent la couleur rose-rouge de la contre-tache.

Matériaux nécessaires:

Slide, loop, coloration primaire (cristal violet), mordant (gramme d'iode), agent décolorant (éthanol à 95%), contre-coloration (safranine), culture en bactéries dans un bouillon / incliné / sur plaque, microscope, huile d'immersion.

Procédure:

1. Une lame est correctement nettoyée sous l'eau du robinet, de sorte que l'eau ne reste pas sous forme de gouttes sur sa surface (Figure 5.11).

2. L'eau adhérente est essuyée avec du papier absorbant et la lame est séchée à l'air.

3. Un frottis de bactérie est préparé au centre de la lame selon les deux méthodes suivantes.

(une) Si une bactérie cultivée sur une plaque d'agar ou une inclinaison d'agar doit être observée, une goutte d'eau est placée au centre de la lame et une boucle de bactéries provenant de la plaque ou inclinée est transférée à celle-ci par une boucle stérilisée sur flamme. Ensuite, par une rotation lente de la boucle dans la goutte, une suspension bactérienne est préparée et elle se répand jusqu'à l'obtention d'un frottis.

(b) Si une bactérie cultivée dans un bouillon liquide doit être observée, une goutte de la suspension de bactéries est directement placée au centre de la lame par une boucle stérilisée à la flamme et un frottis est effectué par étalement.

4. Le frottis est séché à l'air.

5. Le frottis est fixé par chauffage. Le chauffage entraîne la coagulation des protéines cellulaires, grâce à quoi les cellules adhèrent à la surface de la lame et ne sont pas lavées lors de la coloration. La fixation à la chaleur se fait en passant rapidement la lame au-dessus d'une flamme 2 à 3 fois, avec le frottis. surface tournée vers le haut, de sorte que le frottis ne soit pas échauffé.

6. La lame est maintenue sur un plateau à coloration et inondée pendant une minute de la teinture primaire, le violet violet.

7. Les taches en excès sont lavées du frottis sous l'eau du robinet qui coule doucement, de manière à ce que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

8. Le frottis est inondé avec le mordant, l'iode de Gram, pendant 1 minute.

9. Le mordant en excès est lavé du frottis sous l'eau du robinet qui coule doucement, de manière à ce que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

10. Le frottis est inondé pendant 5 secondes avec le décolorant, à savoir de l'éthanol à 95%, en veillant à ce que le frottis ne soit pas décoloré.

11. L'éthanol est rapidement éliminé du frottis sous un jet d'eau du robinet qui coule doucement, afin d'éviter une décoloration excessive. Des précautions sont prises pour que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

12. Le frottis est inondé de la contre-tache, safranine, pendant 1 minute.

13. L'excès de contre-tache est lavé du frottis sous l'eau du robinet qui coule doucement, de manière à ce que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

14. La lame est essuyée avec du papier absorbant.

15. La lame est fixée sur la platine du microscope et le frottis est observé sous des objectifs de faible puissance et de forte sécheresse.

16. Une goutte d'huile d'immersion est appliquée sur le frottis.

17. Le frottis est observé sous l'objectif d'immersion dans l'huile.

Observations (objectif sous immersion dans l'huile):

1. Couleur des cellules:

Violet-bleu: bactérie à Gram positif

Rose-rouge: bactéries à Gram négatif

2. Forme des bactéries:

Sphérique (coccus)

En forme de baguette (bacilles)

Comme une virgule

Spirale (spirochètes)

3. Disposition des bactéries:

Paires (diplobacillus / diplococcus)

À quatre (tétrades)

En chaînes (streptocoque / streptobacille)

Grappes de type raisin (staphylocoque)

Cuboïdal (sarcinae ou octet)

4. Taille des bactéries:

Par estimation oculaire, dessinez le champ sous l'objectif d'immersion dans l'huile.

Réaction Gram-variable:

Dans certains cas, les cellules à Gram positif apparaissent comme des cellules à Gram négatif. C'est ce qu'on appelle la réaction gram-variable.

Les raisons sont les suivantes:

(a) Une surdécoloration peut survenir, entraînant également la perte de la couleur violette des cellules gram-positives.

(b) Une sur-fixation peut survenir, entraînant la perte de la capacité des cellules gram-positives à résister à la décoloration.

(c) Si une ancienne culture de bactéries est utilisée, les composants de la paroi cellulaire peuvent changer avec l’âge des cellules, ce qui permet la décoloration.