Expérience sur la coloration à l'acide-rapide d'une bactérie

Faites des expériences sur la coloration à résistance acide d’une bactérie pour déterminer si elle est résistante à l’acide ou non!

Objectif:

La plupart des bactéries peuvent être colorées, soit par une simple coloration de base, soit par une coloration de Gram, car leurs cellules absorbent facilement les taches.

Cependant, certaines bactéries possèdent une paroi cellulaire cireuse épaisse constituée de matériaux lipidiques.

Ces bactéries sont extrêmement difficiles à colorer, car les colorants aqueux ordinaires ne peuvent pas pénétrer dans leurs cellules, mais une fois colorés; il est également difficile d'éliminer la tache de leurs cellules, même en cas d'utilisation vigoureuse d'un acide-alcool comme agent décolorant. Ces bactéries sont colorées par une coloration acide-rapide.

Ainsi, la coloration acido-résistante, similaire à la coloration de Gram, est une méthode de coloration différentielle, qui différencie les bactéries, en fonction de la nature de leur paroi cellulaire, en deux groupes, comme suit:

(1) Bactéries acido-résistantes:

Une bactérie, qui est extrêmement difficile à colorer, mais une fois colorée, il est tout aussi difficile d’éliminer la tache de ses cellules, même avec une utilisation vigoureuse de l’acide-alcool en tant qu’agent décolorant, est une bactérie résistante à l’acide. bactéries).

Exemples: Mycobacterium spp. [M. tuberculose (bactérie de la tuberculose), M. leprae (bactérie de la lèpre), M. smegmatis (bactérie naturelle de smegma) et M. marinum (bactérie de la tuberculose des poissons marins). Ils possèdent une paroi cellulaire cireuse épaisse constituée de matériaux lipidiques.

(2) Bactéries non acido-résistantes:

Une bactérie, facile à colorer et à décolorer par l’acide-alcool en tant qu’agent décolorant, est une bactérie peu acide (non acid-acid). Exemples: Toutes les bactéries sauf Mycobacterium spp. Chez ces bactéries, la paroi cellulaire n'est ni épaisse ni cireuse.

La coloration acido-résistante est utile pour différencier les bactéries acido-résistantes et non acido-acido-résistantes, ainsi que pour l'identification des bactéries appartenant au genre Mycobacterium.

Principe:

Les bactéries acido-résistantes sont différentes des bactéries non acido-résistantes en ce sens qu'elles possèdent une épaisse paroi cellulaire cireuse constituée de matières lipidiques. Les taches aqueuses ordinaires, telles que le bleu de méthylène ou le cristal violet, ne peuvent pas pénétrer dans leurs cellules par cette paroi cellulaire cireuse.

Cependant, le colorant primaire phénolique de couleur rouge, le carbol fuchsine (acide phénolique ou phénol + fuchsine basique); qui est soluble dans les matières lipidiques de la paroi cellulaire, peut pénétrer dans leurs cellules à travers la paroi cellulaire et peut être retenu à l'intérieur des cellules en leur donnant une couleur rouge.

La pénétration de la carbol-fuchsine à travers la paroi lipoïdale dans le cytoplasme augmente encore la pénétration de chaleur. (Une légère modification de cette méthode de Ziel-Neelsen décrit l'addition d'un agent mouillant, le Turgitol, à la teinture, ce qui réduit la tension superficielle entre la paroi de la cellule et la teinture, ne nécessitant par conséquent aucun chauffage). Les cellules sont laissées à refroidir, de manière à durcir la paroi cellulaire cireuse.

Lorsque les cellules sont exposées à l'agent de décoloration acide-alcool, elles résistent à la décoloration, car le colorant primaire est plus soluble dans les cires cellulaires que dans l'agent de décoloration. Par la suite, lorsqu'il est contre-coloré au bleu de méthylène, il ne peut pas pénétrer dans les cellules à travers la paroi cellulaire cireuse.

Ainsi, finalement, les bactéries acido-résistantes conservent la couleur rouge de la tache primaire et apparaissent en rouge. Par ailleurs, les bactéries non acides résistent facilement à la tache primaire et à la décoloration. Lorsqu'elles sont contre-colorées au bleu de méthylène, ces cellules incolores absorbent facilement la contre-coloration et apparaissent en bleu, contrairement aux bactéries acido-résistantes, qui apparaissent en rouge.

Matériaux nécessaires:

Slide, loop, coloration primaire (carbol fuchsine), décolorant (acide-alcool), contre-coloration (bleu de méthylène), plaque chauffante, culture en bouillon / culture inclinée / bactérie sur plaque, microscope, huile d'immersion.

Procédure:

1. Une lame est correctement nettoyée sous l'eau du robinet, de sorte que l'eau ne reste pas sous forme de gouttes sur sa surface (Figure 5.12).

2. L'eau adhérente est essuyée avec du papier absorbant et la lame est séchée à l'air.

3. Un frottis de bactérie est préparé au centre de la lame selon les deux méthodes suivantes.

(a) Si les bactéries développées sur une plaque d'agar ou une inclinaison d'agar doivent être observées, une goutte d'eau est placée au centre de la lame et une boucle de bactéries provenant de la plaque ou inclinée lui est transférée par une boucle stérilisée sur flamme. . Ensuite, par une rotation lente de la boucle dans la goutte, une suspension bactérienne est préparée et elle se répand jusqu'à l'obtention d'un frottis.

(b) Si des bactéries développées dans un bouillon liquide doivent être observées, une goutte de la suspension de bactéries est directement placée au centre de la lame par une boucle stérilisée à la flamme et un frottis est réalisé par étalement.

4. Le frottis est séché à l'air.

5. Le frottis est fixé par chauffage. Le chauffage entraîne la coagulation des protéines cellulaires, grâce à quoi les cellules adhèrent à la surface de la lame et ne sont pas lavées lors de la coloration. La fixation à la chaleur est effectuée en passant rapidement la diapositive au-dessus d'une flamme 2 à 3 fois, avec la surface du frottis dirigée vers le haut, de sorte que le frottis ne soit pas chauffé.

6. Le frottis est inondé de fuchsine de carbol

7. La lame est placée sur une assiette chaude, laissant la préparation cuire à la vapeur pendant 5 minutes. La température de la plaque chauffante est tellement ajustée que la préparation ne bout pas et s’évapore rapidement. La perte par évaporation est reconstituée afin que le frottis ne se dessèche pas. (Pour la méthode sans chaleur, le frottis est inondé pendant 3-5 minutes avec du carbol fuchsine contenant du Turgitol).

8. La lame est retirée de la plaque chauffante et refroidie.

9. Les taches en excès sont lavées du frottis sous l'eau du robinet qui coule doucement, de manière à ce que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

10. Le décolorant acide-alcool est ajouté goutte à goutte sur le frottis jusqu'à ce que la carbol-fuchsine ne parvienne plus à se décoller du frottis.

11. L'alcool acide est éliminé du frottis sous l'eau du robinet qui coule doucement, de sorte que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

12. Le frottis est inondé de la contre-coloration bleu de méthylène pendant 2 minutes.

13. L'excès de contre-tache est lavé du frottis sous l'eau du robinet qui coule doucement, de manière à ce que l'eau ne tombe pas directement sur le frottis.

14. La lame est essuyée avec du papier absorbant.

15. La lame est fixée sur la platine du microscope et le frottis est observé sous des objectifs de faible puissance et de forte sécheresse.

16. Une goutte d'huile d'immersion est appliquée sur le frottis.

17. Le frottis est observé sous l'objectif d'immersion dans l'huile.