Méthodes biologiques d'évaluation des médicaments

Lorsque les méthodes d'évaluation physiques ou chimiques ou la quantité d'échantillon sont très faibles et ne sont pas en mesure de produire un résultat satisfaisant pour les médicaments, les médicaments sont évalués par des méthodes d'évaluation biologiques. Ces méthodes sont effectuées sur des animaux vivants en isolant des organes et tissus vivants, des préparations animales et des micro-organismes. Les méthodes biologiques d'évaluation sur des organismes vivants sont appelées essais biologiques ou essais biologiques.

La méthode suivante est utilisée comme:

1. Activité anti-inflammatoire des médicaments

2. Activité antipyrétique des médicaments

3. Activité antidiabétique des médicaments

4. Activité analgésique des drogues

5. Activité anti-ulcéreuse des médicaments

6. Activité du médicament anthelminthique: ils sont effectués sur les vers de terre

7. Activité cardiaque du médicament: les glycosides cardiaques sont évalués sur des grenouilles et des pigeons

8. Méthodes microbiologiques: les bactéries vivantes, les levures et les moisissures sont utilisées pour doser les vitamines et déterminer l'activité des médicaments antibiotiques.

Activité anti-inflammatoire du médicament:

Méthode de l'œdème de la patte:

On utilise des rats Sprague-Dawley mâles ou femelles pesant entre 100 et 150 g. Les animaux sont affamés pendant la nuit. Pour assurer une hydratation uniforme, les rats reçoivent 5 ml d’eau par sonde gastrique (témoins) ou le médicament à tester dissous ou en suspension dans le même volume. Trente minutes plus tard, les rats sont stimulés par une injection sous-cutanée de 0, 05 ml de solution de carraghénane à 1% dans le côté plantaire de la patte postérieure gauche. La patte est marquée à l'encre au niveau de la malléole latérale et immergée dans le mercure jusqu'à cette marque.

Le volume de la patte est mesuré de manière pléthysmographique immédiatement après l'injection, de nouveau 3 h à 6 h et éventuellement 24 h après la provocation. L'augmentation du volume de la patte après 3 ou 6 h est calculée en pourcentage par rapport au volume mesuré immédiatement après l'injection de l'agent irritant pour chaque animal.

Les animaux traités efficacement présentent beaucoup moins d'œdème. La différence entre les valeurs moyennes entre les animaux traités et les groupes de contrôle est calculée pour chaque intervalle de temps et évaluée statistiquement. Les différences aux différents intervalles de temps donnent quelques indications sur la durée de l'effet anti-inflammatoire. Une courbe dose-réponse est exécutée pour les médicaments actifs et les valeurs de DE ₅₀ peuvent être déterminées.

Méthode du granulome de coton:

Des rats Wister mâles d'un poids moyen de 200 g sont anesthésiés à l'éther. La peau du dos est rasée et désinfectée avec de l'éthanol à 70%. Une incision est faite dans la région lombaire. Par une pince émoussée, des tunnels sous-cutanés sont formés et une boulette de coton stérilisée est placée des deux côtés dans la région scapulaire.

Les pastilles sont soit normalisées pour une utilisation en dentisterie pesant 20 mg, soit formées à partir de coton brut, produisant une inflammation plus prononcée que le coton blanchi. Les animaux sont traités pendant 7 jours par voie sous-cutanée ou orale.

Ensuite, les animaux sont sacrifiés, les pellets sont préparés et séchés jusqu'à ce que le poids reste constant. Le poids sec net, c'est-à-dire après soustraction du poids de la boulette de coton, est déterminé. Le poids moyen des granulés du groupe de contrôle ainsi que du groupe de test est calculé. Le pourcentage de variation du poids du granulome par rapport au groupe témoin du véhicule est déterminé.

Activité antipyrétique du médicament:

On peut utiliser des lapins des deux sexes et de diverses souches d’un poids corporel compris entre 3 et 5 kg. Les animaux sont placés dans des cages appropriées et des thermocouples reliés à un enregistreur automatique sont introduits dans le rectum. Les animaux sont autorisés à s'adapter aux cages pendant 60 min.

Ensuite, 0, 2 ml / kg contenant 0, 2 µg de lipopolysaccharide est injecté par voie intraveineuse dans l'oreille du lapin. Soixante minutes plus tard, le composé à tester est administré par voie sous-cutanée ou orale. La température corporelle est surveillée pendant au moins 3 heures.

Une diminution de la température corporelle pendant au moins 0, 5 ° C pendant plus de 30 minutes par rapport à la valeur de température avant l'administration du composé à tester est considérée comme un effet positif. Ce résultat a été trouvé après 45 mg / kg de phénylbutazone sous-cutanée ou 2, 5 mg / kg d'Indométacine sous-cutanée.

Activité antidiabétique des médicaments:

Diabète induit par la streptozotocine:

Des rats Wister mâles pesant 150 à 220 g nourris avec un régime standard reçoivent 60 mg / kg de streptozotocine (Calbiochem) par voie intraveineuse. Comme avec l’alloxane, on observe trois phases de changement de la glycémie. Au début, la glycémie est augmentée et atteint des valeurs de 150 à 200 mg% après 3 h. Six huit heures après la streptozotocine, les valeurs sériques de l'insuline sont multipliées par 4, ce qui entraîne une phase hypoglycémique suivie d'une hyperglycémie persistante. La gravité et l'apparition des symptômes du diabète dépendent de la dose de streptozotocine.

Après la dose de 60 mg / kg par voie intraveineuse. Les symptômes se manifestent déjà après 24 à 48 heures avec une hyperglycémie pouvant atteindre 800 mg%, une glucosurie et une cétonémie. Histologiquement, les cellules bêta sont dégranulées ou même nécrotiques. Un état d'équilibre est atteint après 10-14 jours, ce qui permet d'utiliser les animaux pour des tests pharmacologiques.

Diabète induit par l'alloxane: des lapins pesant de 2, 0 à 3, 5 kg reçoivent 150 mg / kg d'alloxane monohydraté dans la veine auriculaire (5, 0 g / 100 ml, pH 4, 5) pendant 10 minutes, ce qui a provoqué l'hyperdiglycémie et l'uricosurie chez 70% des animaux. Les autres animaux meurent ou ne sont que temporairement hyperglycémiques.

Activité analgésique du médicament:

Méthode de la plaque chauffante:

Des groupes de 10 souris de l'un ou l'autre sexe avec un poids initial de 18 à 22 g sont utilisés pour chaque dose. La plaque chauffante, disponible dans le commerce, consiste en une surface chauffée électriquement. La température est contrôlée entre 55 et 56 ° C. Cela peut être une plaque de cuivre ou une surface de verre chauffée. Les animaux sont placés sur la plaque chauffante et le chronomètre indique le temps écoulé avant le léchage ou le saut. La latence est enregistrée avant et après 20, 60 et 90 minutes après l'administration orale ou sous-cutanée de l'étalon ou du composé à tester.

Test d'immersion de la queue:

De jeunes rats femelles Wister (170 à 210 g de poids corporel) sont utilisés. Ils sont placés dans des cages individuelles de retenue, laissant la queue pendre librement. Les animaux sont autorisés à s’adapter aux cages pendant 30 minutes avant le test. La partie inférieure de 5 cm de la queue est marquée. Cette partie de la queue est immergée dans une tasse d’eau fraîchement remplie à exactement 55 ° C. En quelques secondes, le rat réagit en retirant la queue. Le temps de réaction est enregistré en unités de 0, 5 s par un chronomètre. Après chaque détermination, la queue est soigneusement séchée.

Le temps de réaction est déterminé avant et périodiquement après l'administration orale ou sous-cutanée de la substance d'essai, par exemple après 0, 5, 1, 2, 3, 4 et 6 h. Le temps limite de l'immersion est de 15 s. Le temps d'attente des animaux non traités est compris entre 1 et 5, 5 s. Un temps d'attente de plus de 6 s est donc considéré comme une réponse positive.

Méthode de la pince à queue de Heffner:

Un clip d'artère est appliqué à la racine de la queue de souris et le temps de réaction est noté. On utilise des souris mâles (souche Charles River ou autres souches) pesant entre 18 et 25 g. Le groupe de contrôle est composé de 10 souris. Les composés à tester sont administrés par voie sous-cutanée à des souris nourries ou par voie orale à des animaux à jeun. Les groupes de test et le groupe témoin sont composés de 7 à 10 souris.

Le médicament est administré 15, 30 ou 60 minutes avant le test. Une pince artérielle est appliquée à la racine de la queue (à environ 1 cm du corps) pour induire une douleur. L'animal réagit rapidement à ce stimulus nocif en mordant le clip ou la queue près de l'emplacement du clip. Le temps entre le début de la stimulation et la réponse est mesuré par un chronomètre par incréments de 1/10 de seconde.

Activité antiulcéreuse :

Ligation de Pylorus chez le rat (Shay Rat):

Des rates Wister pesant entre 150 et 170 g sont privées de nourriture pendant 48 heures et ont accès à de l'eau potable à volonté. Pendant ce temps, ils sont logés seuls dans des cages avec des fonds en relief de larges mailles métalliques afin d'éviter le cannibalisme et la coprophagie. Dix animaux sont utilisés par dose et comme contrôle. Sous anesthésie à l'éther, une incision abdominale médiane est pratiquée. Le pylore est légalisé, en veillant à ne pas endommager le sang.

Aucune alimentation ou traction sur le pylore ne se produit. Saisir l'estomac avec des instruments doit être méticuleusement évité; sinon, l'ulcération se développera invariablement à ces endroits. La paroi abdominale est fermée par des sutures. Les composés à tester sont administrés oralement par gavages ou injectés par voie sous-cutanée.

Les animaux sont placés pendant 19 h dans des cylindres en plastique d'un diamètre intérieur de 45 mm fermés aux deux extrémités par un treillis métallique. Ensuite, les animaux sont sacrifiés sous anesthésie au CO ₂ . L'abdomen est ouvert et une ligature est placée autour de l'œsophage près du diaphragme.

L'estomac est enlevé et le contenu est drainé dans un tube à centrifuger. Le long de la plus grande courbure, l’estomac est ouvert et épinglé sur une plaque de liège. La muqueuse est examinée avec un microscope stéréo. Chez le rat, les deux cinquièmes supérieures de l'estomac forment le rumen avec un épithélium squameux et possèdent peu de mécanismes de protection contre l'action corrosive du suc gastrique.

Au-dessous d'une crête limitante, dans la partie glandulaire de l'estomac, les mécanismes de protection sont meilleurs dans la muqueuse des deux cinquièmes de l'estomac que dans la partie inférieure, formant l'antre.

Par conséquent, les lésions se produisent principalement dans le rumen et dans l'antre. Le nombre d'ulcères est noté et la gravité enregistrée avec les scores suivants:

. 0 = pas d'ulcère

. 1 = ulcères superficiels

. 2 = ulcères profonds

. 3 = perforation.

Le volume du contenu gastrique est mesuré. Après centrifugation, l’acidité est déterminée par titration avec 0, 1 n NaOH.

Évaluation:

Une interface utilisateur d'index d'ulcère est calculée:

UI = UN + US + UP x 10-1

je. UN = nombre moyen d'ulcères par animal

ii. US = moyenne du score de gravité

iii. UP = pourcentage d'animaux atteints d'ulcères

L'indice d'ulcère et l'acidité du contenu gastrique des animaux traités sont comparés aux témoins. En utilisant diverses doses, des courbes dose-réponse peuvent être établies pour la formation d’ulcère et la sécrétion d’acide gastrique. Les valeurs ID50 peuvent être calculées par analyse de probité, 0% correspondant à un débit nul et 100% à la production maximale d'acide gastrique stimulée.

Ulcère de stress par le stress d'immobilisation:

On utilise des groupes de 10 rats Wister femelles par dose du médicament à l'essai et pour les témoins pesant 150 à 170 g. La nourriture et l'eau sont retirées 24h avant l'expérience. Après administration orale ou sous-cutanée du composé à tester ou de la solution placebo, les animaux sont légèrement anesthésiés à l'éther.

Les extrémités inférieure et supérieure sont fixées ensemble et les animaux sont enveloppés dans un regard métallique. Ils sont suspendus horizontalement dans le noir à 20 ° C pendant 24 h et sont finalement sacrifiés sous anesthésie au CO ₂ . L'estomac est enlevé, fixé sur une plaque de liège et le nombre et la gravité des ulcères sont enregistrés avec un stéréomicroscope en utilisant les scores suivants:

.0 = pas d'ulcère

.1 = ulcères superficiels

.2 = ulcères profonds.

.3 = perforation

Évaluation

Une interface utilisateur d'index d'ulcère est calculée:

UI = UN + US + UP x 10-1

ONU - nombre moyen d'ulcères par animal.

US = moyenne du score de gravité.

UP - pourcentage d'animaux atteints d'ulcères