Animaux transgéniques: objectifs du transfert de gènes avec différentes méthodes de transfection

Animaux transgéniques: objectifs du transfert de gènes avec différentes méthodes de transfection!

Un animal transgénique contient dans son génome un gène ou des gènes introduits par l'une ou l'autre des techniques de transfection.

Le gène introduit par transfection s'appelle un transgène. La transfection chez les animaux spécifie l'introduction d'un segment d'ADN, soit nu, soit intégré dans un vecteur, dans une cellule animale.

Objectifs du transfert de gènes:

1. La modification génétique des animaux peut viser à améliorer leur production de lait, de viande, de laine, etc.

2. Des gènes ont été transférés chez des animaux pour obtenir une production à grande échelle des protéines codées par ces gènes dans le lait, l'urine ou le sang de ces animaux.

3. Un cas particulier de transfert de gènes vise à atténuer, voire à éliminer les symptômes et les misères qui en résultent, liés aux maladies génétiques. Dans cette approche, des copies normales et fonctionnelles du gène défectueux sont introduites chez le patient (thérapie génique).

4. Des souches ou lignées animales transgéniques spécifiques sont créées pour répondre à des besoins expérimentaux et / ou biomédicaux spécialisés.

Méthodes de transfection:

Plusieurs approches ont été utilisées pour l'introduction de l'ADN dans les cellules / embryons animaux:

i) Précipitation de phosphate de calcium.

(ii) Microinjection directe.

(iii) infection à retrovirus.

(iv) lipofection.

(v) livraison de pistolet à particules et

(vi) Electropoiation.

Précipitation de phosphate de calcium:

Dans cette approche, la préparation d'ADN à utiliser pour la transfection est d'abord dissoute dans un tampon phosphate. Une solution de chlorure de calcium est ensuite ajoutée à la solution d'ADN; cela conduit à la formation de phosphate de calcium insoluble qui co-précipite avec l'ADN. Le précipité ADN phosphate de calcium est ajouté aux cellules à transfecter.

Les particules précipitées sont absorbées par les cellules par phagocytose. Initialement, 1-2% des cellules ont été transfectées par cette approche. Mais la procédure a maintenant été modifiée pour obtenir la transfection de jusqu'à 20% des cellules. Dans une faible proportion des cellules transfectées, l'ADN est intégré au génome de la cellule, ce qui produit une transfection stable ou permanente.

Cette approche générale peut être appliquée à pratiquement toutes les cellules de mammifère et un très grand nombre de cellules peuvent être traitées avec un minimum d'effort. Mais de nombreuses lignées cellulaires n'aiment pas le précipité de phosphate de calcium adhérant à leurs surfaces ou à leur substrat.

Lipofection:

La libération d'ADN dans les cellules à l'aide de liposomes est appelée lipofection. Les liposomes sont de petites vésicules préparées à partir d'un lipide approprié. Initialement, les lipides non ioniques étaient utilisés pour préparer les liposomes, de sorte que l’ADN devait être introduit dans les vésicules à la suite de procédures d’encapsidation spécifiques.

L'utilisation de lipides cationiques pour la construction de liposomes est un avantage distinct, car l'ADN se complexifie spontanément et efficacement avec ces liposomes, rendant les procédures d'encapsidation inutiles. Les liposomes cationiques ont une seule membrane bicouche lipidique (unilamellaire) et se lient efficacement aux cellules. Ils fusionnent probablement avec la membrane plasmique et transmettent ainsi l'ADN (complexé avec celle-ci) aux cellules, ce qui entraîne la transfection.

La lipofection est la méthode de choix pour la transfection in vitro de cellules de mammifères. Il a également été utilisé pour administrer de l'ADN à des animaux vivants par injection directe ou intraveineuse. Les liposomes cationiques ont été utilisés en injection intraveineuse ou intratrachéale chez la souris pour l'expression de gènes marqueurs dans les poumons. La délivrance ciblée a également été démontrée en incorporant des protéines de ligand spécifiques dans les membranes des liposomes.

Infection rétrovirale:

Les rétrovirus recombinants produisent des virions, qui sont utilisés pour infecter des cellules animales et des embryons de souris. Le génome de l'ARN de rétrovirus recombinant est copié par transcriptase inverse pour donner une copie de l'ADN (transcription de revenu), qui s'intègre dans le génome de la cellule. La transcriptase inverse est codée par le rétrovirus et est produite immédiatement après l'infection.

Cependant, la transcription inverse ne peut se produire que dans les cellules qui passent par la phase S, c'est-à-dire qui sont actives sur le plan mitotique. La copie d'ADN du retrovirus recombinant s'intègre dans le génome cellulaire en des sites aléatoires et ne s'accompagne généralement pas de délétions ni de réarrangements.

Microinjection:

Dans cette méthode, la solution d’ADN est injectée directement dans le noyau d’une cellule ou dans le pronucleus mâle d’un ovule fécondé à une ou deux cellules. Typiquement, un ensemble de microinjection consiste en un microscope à dissection stéréoscopique de faible puissance (pour visualiser l’ovule et l’ensemble du processus) et en deux micromanipulateurs, l’un pour une micropipette en verre servant à maintenir l’ovule par aspiration partielle et ADN dans le pronucleus masculin. Le pronucleus mâle est beaucoup plus gros que le pronucleus femelle d'ovules de mammifères fécondés. Cependant, dans les ovules de poisson, l'ADN est injecté dans le cytoplasme de l'œuf.

La procédure générale de microinjection est la suivante: On induit les femelles donneuses à super ovuler à l’aide de traitements hormonaux appropriés. Les femelles superovulées sont ensuite accouplées à des mâles fertiles et un grand nombre d'ovules / embryons à une ou deux cellules fertilisés sont prélevés par voie chirurgicale. Alternativement, des ovules non fertilisés sont prélevés chez des femelles super-ovulées; les ovules sont ensuite fécondés in vitro. La construction transgénique est préparée dans une solution tampon et est injectée dans le pronuctei mâle des œufs fécondés en utilisant un ensemble de microinjection.