HLA: méthodes de test d'histocompatibilité

Méthodes de test d'histocompatibilité!

Le système HLA est largement polymorphe. La nature polymorphe des allèles HLA a été initialement définie et définie par des méthodes sérologiques et les antigènes HLA ont été numérotés. Plus tard, il a été découvert que des antigènes ayant la même spécificité sérologique pouvaient avoir des séquences d'acides aminés différentes. En 1999, le nombre d'allèles HLA connus était supérieur à 1 000 et il continue d'augmenter. En raison du polymorphisme étendu, la nomenclature des allèles HLA est complexe et il est également difficile pour une personne de comprendre la nomenclature, à moins que la personne ne se trouve dans le champ d'histocompatibilité.

Les premiers allèles séquencés se sont vu attribuer des noms avec deux chiffres correspondant à leur spécificité sérologique. Les deux premiers chiffres sont suivis de deux autres chiffres indiquant l'ordre chronologique de désignation par le Comité de la nomenclature de l'OMS pour les facteurs du système HLA. (Par exemple. Le premier allèle séquencé à partir d'un gène HLA-A2 a été nommé HLA-A 0201 et le deuxième allèle séquencé a été nommé HLA-A 0202.)

Le typage HLA est effectué par des méthodes de typage sérologique ou moléculaire. Les méthodes sérologiques de typage HLA détectent les épitopes des molécules HLA, alors que les méthodes moléculaires détectent les séquences nucléotidiques.

je. Le typage HLA qui définit des groupes d'allèles (généralement une approximation des spécificités sérologiques) est appelé typage basse résolution ou générique (par exemple, HLA-DRBl-04).

ii. Le typage qui résout tous les allèles connus est appelé typage HLA haute résolution (par exemple, HLA-DR BI x401).

iii. Le typage qui résout au-delà des spécificités sérologiques mais n'atteint pas le niveau d'allèle est appelé typage de résolution intermédiaire (par exemple, HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

Le programme national de donneurs de moelle a créé un code pour faciliter la gestion de ces données complexes à résolution intermédiaire. Dans ce système, le nom de HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / est DRBl-04EJV.

Tests d'histocompatibilité par méthodes sérologiques:

Les lymphocytes sont utilisés pour le typage HLA sérologique, le criblage d'anticorps et la correspondance.

Isolement des lymphocytes pour le typage HLA:

je. Le sang veineux périphérique est mélangé avec du Ficoll-Hypaque et centrifugé. La couche contenant les cellules mononucléées du sang périphérique est aspirée, lavée et utilisée.

ii. Les lymphocytes isolés des ganglions lymphatiques et de la rate des cadavres sont utilisés.

iii. Le typage HLA pour les antigènes de classe II est effectué sur des populations de cellules B enrichies (environ 80% des cellules T normales du sang périphérique sont des cellules T au repos dépourvues d'antigènes de classe II à leur surface).

iv. Des billes magnétiques revêtues d'AcM anti-CD2 ou anti-CD3 sont utilisées pour isoler les cellules T; et des billes magnétiques revêtues d'AcM anti-CD19 sont utilisés pour isoler les cellules B.

Détection des antigènes HLA des lymphocytes:

Le test de micro cytotoxicité est un test de cytotoxicité de la lymphe dépendant du complément. Des plateaux de typage congelés contenant des puits recouverts de différents anticorps contre les antigènes HLA sont disponibles dans le commerce.

Environ 2000 lymphocytes sont distribués dans chaque puits du plateau et incubés pendant 30 minutes à température ambiante. (Les anticorps dans chaque puits se lient aux antigènes HLA spécifiques à la surface des lymphocytes, le cas échéant.)

↓

5 µl de complément (généralement du sérum de lapin) sont ajoutés à chaque puits et incubés pendant 60 minutes (les protéines du complément entraînent la mort de lymphocytes recouverts d’AcM. En l’absence de liaison de l’AcM avec les lymphocytes, le complément n’est pas activé et les lymphocytes ne sont pas tués).

↓

Le colorant éosine Y, suivi du formaldéhyde (le formaldéhyde fixe la réaction) sont ajoutés.

↓

Ensuite, les cellules mortes et les cellules vivantes dans chaque puits sont comptées au microscope à contraste de phase.

je. Les cellules enflées et sombres sont des cellules mortes (le colorant éosine Y pénètre dans les cellules mortes).

ii. Les cellules brillantes et réfractiles sont des cellules vivantes (le colorant éosine Y n'entre pas dans les cellules vivantes).

Chaque puits du plateau est visualisé individuellement pour les cellules mortes et les cellules vivantes. Le pourcentage de cellules mortes dans chaque puits est calculé et la notation est effectuée conformément au tableau 27.5.

Tableau 27.5: Notation du test de cytotoxicité lymphatique pour HLA:

Le type HLA d'un individu est déterminé par l'interprétation de la réaction de ses lymphocytes avec différents antisérums utilisés dans le test de cytotoxicité de la lymphe dépendant du complément.

je. Chaque individu devrait avoir deux antigènes HLA-A, deux HLA-B et deux HLA-C à la surface des lymphocytes.

ii. Si un individu ne présente qu'un seul antigène HLA-A ou HLA-B ou HLA-C dans le test, il est probablement homozygote pour cet antigène particulier ou le panel d'antisérums utilisé dans le test ne contient pas l'anticorps spécifique du second antigène. antigène ou la faible expression des molécules HLA à la surface des lymphocytes.

Le test de cytotoxicité de la lymphe dépendant du complément pour les antigènes HLA-DR et HLA-DQ est réalisé en utilisant des cellules B isolées par des billes magnétiques revêtues de mAB ou des cellules B isolées sur de la laine de nylon.

La plupart des sérums de typage HLA proviennent de femmes multipares. Comme les femmes mutiopares sont exposées de manière répétée aux antigènes HLA des fœtus, les sérums des femmes multipares possèdent des anticorps anti-antigènes HLA. Près de 200 antisérums différents sont utilisés pour dactylographier les antigènes HLA d'un individu.

Au départ, on pensait que des AcM de chacun des antigènes HLA pourraient être développés et que le typage HLA serait simple. Mais de nombreux mAb se lient aux épitopes communs plutôt qu'aux épitopes privés des antigènes HLA. En outre, de nombreux AcM murins ne fixent pas le complément (et leur utilisation dans les tests de cytotoxicité lymphatique dépendants du complément est donc limitée).

Cependant, les AcM murins peuvent être utilisés dans les méthodes ELISA et cytométrie en flux, qui ne nécessitent pas de complément. Récemment, de nombreux laboratoires préfèrent utiliser le typage moléculaire HLA plutôt que le typage sérologique HLA.

Criblage du sérum du receveur de greffe à la recherche d'anticorps contre les antigènes l-ILA (criblage d'anticorps):

La présence d'anticorps anti-antigènes HLA dans le sérum d'un receveur d'un greffon d'organe en attente se fait généralement par cytotoxicité lymphatique dépendante du complément. Les lymphocytes contenant les antigènes HLA et le complément connus sont mélangés au sérum du receveur. Après une incubation appropriée, les lymphocytes morts et les lymphocytes vivants sont comptés. Le pourcentage d'anticorps réactif de panel (PRA) est ensuite calculé.

PRA = nombre de cellules positives / nombre total de cellules du panel x 100

L'ARP indique l'étendue de la sensibilisation du destinataire en attente aux antigènes HLA.

Méthode ELISA permettant de cribler les anticorps HLA du sérum:

La méthode ELISA est facile, rapide et ne nécessite pas de lymphocytes vivants ni de complément. Des antigènes HLA purifiés par affinité sont appliqués sur les parois de la plaque de microtitration

↓

Le sérum du receveur est ajouté et incubé

↓

Après lavage, une IgG anti-humaine conjuguée à une enzyme est ajoutée et incubée.

↓

Après lavage, le substrat est ajouté et incubé.

je. Le développement de la couleur dans un puits particulier indique la présence d'anticorps IgG dirigés contre l'antigène HLA appliqué sur ce puits particulier.

ii. Le non développement de couleur dans un puits particulier indique l'absence d'anticorps dirigés contre l'antigène HLA particulier appliqué sur ce puits.

Cytomètre de flux pour détecter les anticorps HLA sériques:

Des microbilles recouvertes d'antigènes HLA sont incubées avec le sérum du patient puis avec des anticorps anti-IgG humains marqués par fluorescence. Le pourcentage de billes qui se colorent au-dessus de l'arrière-plan fournit la mesure du pourcentage d'anticorps réactifs au panel (PRA) du patient.

Compatibilité croisée:

Si le sang d'un destinataire en attente contient des anticorps contre les antigènes HLA du donneur, les antigènes HLA des cellules du donneur seront attaqués par les anticorps du receveur lors de la transplantation. Par conséquent, avant de procéder à une greffe, il est essentiel de savoir si le receveur possède des anticorps contre les antigènes HLA du donneur.

Si des anticorps spécifiques de l'antigène HLA du donneur sont présents dans le sérum du receveur, le greffon sera rejeté. Un appariement croisé est effectué pour détecter la présence d'anticorps sériques du destinataire en attente contre les antigènes HLA du donneur proposé.

Correspondance croisée de la cytotoxicité lymphatique avec les lymphocytes du sang périphérique:

Les lymphocytes sanguins périphériques du donneur proposé (contenant environ 80% de lymphocytes T (contenant les antigènes du CMH de classe I) et 20% de lymphocytes B et des monocytes (contenant les antigènes du CMH de classe I et de classe II) sont mélangés au sérum du patient en attente et incubés. .

↓

Le complément est ajouté et incubé.

↓

Le colorant éosine Y est ajouté et incubé.

je. Le nombre de cellules mortes et viables est compté et le pourcentage de cellules mortes est calculé. 50% ou plus de mort cellulaire indique une forte compatibilité croisée (le sérum du receveur contient des anticorps capables de réagir avec les antigènes HLA du donneur). Une forte corrélation positive entre un receveur et un donneur proposé constitue une contre-indication à la transplantation d'organe du donneur au receveur.

Pour déterminer si les anticorps du destinataire sont dirigés contre les antigènes de classe I ou de classe II, effectuez respectivement une correspondance croisée de cytotoxicité de la lymphe à cellules T (en utilisant des cellules T enrichies) ou une correspondance de cytotoxicité de la lymphe à cellules B (en utilisant des cellules B enrichies),

La correspondance croisée avec le cytomètre en flux est 30 à 250 fois plus sensible que les méthodes sérologiques visuelles pour la détection des anticorps IgG dirigés contre les antigènes HLA à la surface des lymphocytes.

Les lymphocytes du sang périphérique du donneur proposé sont incubés avec des mAb anti-CD3 marqués (par exemple, un colorant fluorescent qui émet de la lumière verte), qui se lient aux cellules T.

↓

Les lymphocytes T liés à l'ani-CD3 marqués sont séparés des lymphocytes B dans le cytomètre en flux.

↓

Les cellules T colorées et séparées sont maintenant incubées avec le sérum du destinataire en attente.

je. Les anticorps sériques du receveur dirigés contre les antigènes HLA des cellules T du donneur, s'ils sont présents, se lieront aux cellules T.

↓

Après le lavage, on ajoute un IgG anti-humain marqué au flurochrome (qui émet une couleur, autre que le vert, dit le rouge) et on incube.

ii. Les IgG anti-humains marquées au florochrome se lieront aux anticorps anti-HLA du receveur, qui sont liés aux lymphocytes T du donneur.

Le cytomètre en flux compte le nombre de cellules T (couleur rouge et verte) et de cellules T (couleur verte) et crée un histogramme.

Correspondance croisée des autoanticorps contre les lymphocytes:

Au cours d'une compatibilité croisée, les auto-anticorps dirigés contre les lymphocytes dans le sérum du receveur peuvent se lier de manière non spécifique aux lymphocytes du donneur et donner un résultat faux-positif; et par conséquent, le donneur est à tort exclu du don d'organe au receveur particulier. Les auto-anticorps peuvent également masquer la présence d’anticorps anti-donneurs spécifiques.

La présence d'auto-anticorps dirigés contre les lymphocytes est détectée par la compatibilité croisée automatique, dans laquelle les propres lymphocytes et le sérum du receveur sont combinés dans un test de cytotoxicité standard. Les correspondances croisées auto-anticorps sont systématiquement effectuées avec toutes les correspondances croisées entre donneurs vivants pour chaque sérum testé.

Méthodes de biologie moléculaire pour le typage HLA:

La plupart des méthodes de typage moléculaire utilisent la technique de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour amplifier sélectivement les segments du gène HLA nécessaires au typage.

Saisie de type spécifique à la séquence (SSP):

L'ADN de l'individu est extrait de cellules ou de tissus

↓

L'ADN est ajouté à des tubes contenant différents jeux d'amorces pour différents gènes HLA. Un ensemble supplémentaire d'amorces est inclus en tant que contrôle positif de l'amplification dans tous les tubes.

`

Les autres composants de la réaction PCR (tels que les nucléotides d'ADN, l'ADN polymérase, le tampon) sont ajoutés et le cyclage thermique est effectué.

↓

Les produits amplifiés sont soumis à une électrophorèse en gel avec du bromure d’éthidium et photographiés sous lumière UV.

je. La présence d'une bande indique que l'échantillon d'ADN a la séquence correspondant au type HLA particulier.

ii. L'absence de bande indique que l'échantillon d'ADN ne contient pas la séquence particulière du type HLA.

iii. La bande de contrôle d'amplification interne doit être présente pour interprétation.

Des ensembles d’amorces pour le typage HLA sont disponibles dans le commerce.

je. Pour le typage HLA-A, B et C, environ 100 à 200 réactions sont nécessaires.

ii. Pour le typage HLA-DRB, environ 20 à 30 réactions sont nécessaires.

Hybridation de sondes oligonucléotidiques spécifiques à la séquence (SSOP):

La méthode SSOP implique l’amplification sélective de la cible HLA, suivie d’une hybridation sur un panel de sondes oligonucléotidiques. Il existe deux formats SSOP.

je. Dot ou Slot Blot:

L'ADN amplifié est lié au support solide (tel qu'une membrane de nylon) et la sonde d'hybridation est en solution.

ii. Point inverse ou blot de fente:

La sonde est liée au support solide et hybridée à l'ADN amplifié en solution.