Test à l'oxydase sur les bactéries pour déterminer leur capacité à oxyder le cytochrome C réduit

Lisez cet article pour en savoir plus sur le test d'oxydase sur des bactéries afin de déterminer leur capacité à oxyder le cytochrome C réduit:

Principe:

Certaines bactéries ont la capacité d'oxyder le «cytochrome C réduit» présent dans leurs cellules en «cytochrome C oxydé», car elles peuvent produire l'enzyme «cytochrome oxydase».

Le cytochrome C oxydé produit une couleur pourpre (violet de Wurster) avec le colorant N-tétraméthyl-paraphénylènediamine (c'est-à-dire un réactif oxydase).

Dans le test de l'oxydase, des solutions de gélose contenant des colonies de bactéries à tester sont immergées dans la solution de réactif oxydase. Si les bactéries ont la capacité de produire l'enzyme cytochrome oxydase, la couleur des colonies sur les plaques passe au violet. Si les bactéries ne sont pas en mesure de produire de la cytochrome oxydase, les colonies conservent la couleur rose d'origine du réactif oxydase.

Matériaux nécessaires:

Boîtes de Pétri, fiole conique, bouchons en coton, boucle d’inoculation en fil de platine, autoclave, brûleur Bunsen, chambre à écoulement laminaire, pot à incubateur, incubateur, bande de papier filtre Whatman, réactif à l’oxydase (N-tétraméthyl-paraphénylènediamine), colonies isolées ou cultures pures de bactéries.

Procédure:

a) Méthode de la plaque:

1. Deux boîtes de Pétri sont nettoyées, recouvertes de papier kraft et attachées avec du fil ou une bande de caoutchouc (Figure 7.19). Ces étapes ainsi que la stérilisation des boîtes de Pétri à l'étape 6 sont omises, si des boîtes de Pétri stérilisées au four sont utilisées directement.

2. Les ingrédients du milieu gélose nutritive ou de la poudre préparée nécessaire pour 100 ml de milieu sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation et tourbillonnement.

3. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 0 avec HCI 0, 1 N s'il est supérieur ou avec NaOH 0, 1 N s'il est inférieur.

4. Le ballon est chauffé pour dissoudre complètement la gélose dans le milieu.

5. Le ballon est en coton bouché, recouvert de papier kraft et noué avec du fil ou un élastique.

6. Les deux boîtes de Pétri et la fiole conique contenant le milieu nutritif en gélose sont stérilisées à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

7. Après la stérilisation, ils sont sortis de l'autoclave et laissés à refroidir pendant un certain temps, sans laisser le milieu se solidifier. Le refroidissement du fluide empêche la condensation et l’accumulation de gouttelettes d’eau à l’intérieur des plaques. Si le support a déjà été préparé et solidifié pendant le stockage, il doit être liquéfié en chauffant soigneusement jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu.

8. Pour préparer les géloses nutritives, avant de refroidir et de solidifier le milieu stérilisé stérilisé, à chaud, il est versé de manière aseptique, de préférence à l'intérieur d'une chambre à flux laminaire, dans les deux boîtes de Pétri stérilisées (environ 20 ml chacune), de sorte le milieu fondu recouvre complètement le fond des boîtes de Pétri.

Ensuite, les plaques sont recouvertes de leurs couvercles et laissées à refroidir, afin de solidifier le milieu en eux. La vapeur d'eau susceptible de se condenser sur la surface intérieure des plaques et des couvercles est évaporée en maintenant les plaques et les couvercles en position inversée dans un incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure.

9. Chaque plaque est marquée sur le côté inférieur en quatre quarts.

10. L'inoculation localisée des bactéries à tester se fait de manière aseptique, de préférence dans une chambre à flux laminaire, au centre de chaque quartier, en effectuant une tache (ou un petit frottis) de la bactérie à l'aide d'une boucle stérilisée à la flamme. La boucle est stérilisée après chaque inoculation.

11. Les plaques inoculées sont incubées en position inversée, de haut en bas, à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur jusqu'à ce que des colonies de la bactérie soient visibles.

12. Les plaques sont inondées de réactif oxydase.

b) Méthode du papier:

1. Une bande de papier filtre Whatman, trempée dans du réactif à 1% d'oxydase, est séchée et maintenue dans l'obscurité.

2. Avant utilisation, il est humidifié et une boucle de la bactérie à tester est appliquée comme une tache à l’aide d’une boucle en platine. La boucle nichrome peut oxyder le réactif. Par conséquent, la boucle de platine doit être utilisée.

3. La tache est observée après 10 secondes.